교신저자：이흥만, 152-703 서울 구로구 구로동 80번지 고려대학교 의과대학 이비인후- 두경부외과학교실 
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서     론

   호흡상피는 정상적으로 배세포와 점막하 분비선에서 분비되는 점액에 의하여 덮여 있다. 알레르기 비염, 부비동염, 기관지염, 천식 및 낭성 섬유종과 같은 기도의 점액 과분비질환에서 상피층에 존재하는 배세포의 증식, 비대 및 이형성은 기도염증의 병태에 중요한 요인이다.
   배세포로부터의 점액 과분비는 말초 기관지에서 점액전(mucus plug)이 기도를 폐색시켜 천식환자에게 사망을 초래하며, 재채기, 수양성 비루 및 비폐색을 특징으로 하는 알레르기 비염에서 점액과분비는 점액 융단의 sol과 gel층의 양적 혹은 구성 성분에 영향을 미쳐 점액섬모 운동에 장애를 준다.¹⁾²⁾ 그러나, 알레르기성 비염에서 정상적인 점액의 중요성에도 불구하고 점액의 형성 과정에 대한 연구는 부족하다.
   최근 연구에서 생체(in vivo)와 시험관내(in vitro) 실험에서 상피성장인자수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR로 약함)의 활성이 기도 점막에서 중요한 점액 유전자인 MUC5AC mRNA의 발현과 점액 생성에 중요하다고 보고하였다.³⁾⁴⁾ 그러나 비점막에서의 EGFR tyrosine kinase 활성과 점액 생성과의 관계는 밝혀져 있지 않다.
   본 연구에서는 난알부민(ovalbumin)으로 감작시킨 백서의 비점막의 알레르기 염증에서 배세포의 형성이 증가되는지를 관찰하고자 하였고, EGFR tyrosine kinase억제제가 배세포 형성에 미치는 영향을 연구하고자 하였다.

재료 및 방법

실험 프로토콜(Experimental protocol)
   정상 백서에서 경구개의 절치유두(incisive papilla) 위치의 비중격 점막에서 정상적으로 배세포가 존재하기 않는다.⁵⁾ 백서에서 난알부민을 이용하여 알레르기 비염을 유발시켜 점액 유전자의 발현과 배세포의 형성을 유도한 후 배세포에서 EGFR 단백과 MUC5AC 점액 유전자의 발현 유무를 관찰하고자 하였다. 또한 EGFR tyrosin kinase 활성이 난알부민으로 유발된 배세포 형성 및 점액유전자에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 EGFR에 특이한 tyrosine kinase 억제제인 BIBX1522(80 mg/kg, Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Germany)를 난알부민으로 비내로 국소 감작을 시키기 1시간 전에 복강내로 투여하고 매일 두차례 복강내로 투여하여 Alcian blue(pH2.5)/Periodic acid Schiff(AB/PAS)으로 염색된 면적과 MUC5AC 유전자가 억제되는 것을 관찰하고자 하였다.

난알부민의 복강 투여에 의한 감작
   실험동물로는 무병 상태(specific pathogen-free)의 Fisher 344 백서(200~250 g, body wt；Simonsen Laboratories, Gilroy, CA)를 사용하였다. 생리식염수 1 ml당 난알부민(ovalbumin, Sigma chemical Co., St. Louis, MO) 400 g을 녹여 Al(OH)₃(20 mg/ml)와 1：1로 섞어 사용하였다. Asakura⁶⁾의 방법에 따라 1, 2, 3과 11일째에 200 g의 난알부민(1 ml ovalbumin-Al(OH)₃ suspesion)을 복강내 주입하였다. 항원보강제(adjuvant)로는 열처리한 Bordetella pertussis bacilli(10¹⁰ heat-killed bacilli in 50 μl saline；Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan)을 1일째에 foot pad에 주입하였다. 대조군은 난알부민 대신 생리식염수로 상기와 같은 방법으로 시행하였다.

난알부민의 비강내 유발반응(intranasal challenge)
   19일째에 에테르로 백서를 마취한 후 0.1 ml의 생리식염수에 10 mg의 난알부민을 녹인 용액을 3일동안 연속하여 양쪽 비강에 떨어뜨려 백서가 흡기중 흡입하도록 하였다.

난알부민에 특이한 혈청 IgE 항체 농도 측정
   각 실험군의 백서에서 두부 조직을 채취시 심장천자를 통하여 혈액을 채취하여 원심분리를 통해 적혈구는 버리고 혈청을 취득하였다. 난알부민 항체 농도는 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다. 모든 측정은 96-well microtiter plates(Nunc A/S, Roskilde, Denmark)를 사용하였다.
   Carbonate/bicarbonate buffer에 희석한 HRP-conjugated 단크론성 항- 백서 IgE 항체(2 μg/ml, Zymed Lab. Inc., South San Francisco, CA)를 플레이트의 well에 넣은 후 상온에서 하루밤 동안 유치시켰다. 플레이트를 0.5% casein을 함유한 PBS(PBS-casein)로 37°C, 1시간 동안 억제하였다. PBS-casein으로 20배 희석한 혈청을 well에 넣은 후 4°C에서 하루밤 배양하였다. 배양한 후에 biotinlabelled ovalbumin(5 μg/ml)을 well에 첨가하고 하루밤 배양하였다. PBS-casein으로 희석한 alkaline phosphatase-conujugated streptavidin(Zymed, 1：1000)을 첨가하여 37°C에서 1시간 배양하였다. 각 단계 사이에 0.05% Tween-20(Sigma, St. Louis, MO)으로 4번씩 씻었다. Diethanolamine 완충용액에 p-nitrophsophate(1 mg/ml)을 첨가한 후에 분광광도계(Hitachi U-2000, Japan)로 405 nm에서 광학밀도(OD₄₀₅) 값을 구하였다. 난알부민에 특이한 혈청 IgE 항체 농도는 난알부민- 감작 백서에서는 0.13±0.01으로 대조군 백서에서의 0.02±0.02보다 유의하게 증가하였다(p<0.01, n＝6).

표본 제작
   백서를 pentobarbital(65 mg/kg)로 복강내로 마취시킨 후 1% paraformaldehyhe를 120 mmHg 압력으로 심장을 통하여 관류 고정하였다. 단두한 후 안구와 하악, 피부와 근육을 제거한 후 두부를 4% paraformaldehyhe로 다시 24시간 동안 고정하였다. 단두한 두부를 Surgipath(Decalcified II, Surgical Medical Industries Inc., Richmond, IL)으로 5일간 탈회시킨 후, 비강을 절치유두 부위에서 횡으로 자른 후, 일부는 30% 자당으로 하루밤 배양한 후 OCT 혼합물(Sakura Finite USA, Torrance, CA)로 포매하였고, 일부 조직은 파라핀에 포매하였다. 동결 절편기를 이용하여 5 μm 두께로 동결절편을 만들어 면역조직화학적 염색과 in situ hybridization에 이용하였고, 파라핀 절편은 AB/PAS염색을 시행하였다.

EGFR 항체를 이용한 면역조직화학적 염색
   면역조직화학적 염색은 universal LSAB kit(DAKO, Copenhagen, Denmark)를 이용하여 avidin-biotin peroxidase comlpex(ABC)법으로 하였다. 동결절편을 이용하여 내인성 페록시다아제 활성을 억제시키기 위하여 0.3% H₂O₂로 15분간 처리하고 인산완충용액(pH 7.6)으로 세척하였다. 비특이적 항원 항체반응을 억제하기 위하여 3분간 정상 소혈청으로 처리한 후 단크론성 EGFR(Calbiochem, La Jolla, CA) 항체로 4°C에서 하루밤 동안 처리하였다. 이차항체로 biotinylated 항- 마우스 면역글로블린을 사용하여 30분간 반응시켰다. 인산완충용액으로 세척 후 avidin conjugated horse-radish peroxidase에 30분 배양한 후 diaminobenzidine(Sigma, St. Louis, MO)으로 5분간 반응시켜 발색시켰다. 음성 대조군은 위 과정 중 일차항체 대신 인산완충 용액을 반응시켜 관찰하였다.

비점막 상피에서 점액당단백의 형태학적 분석
   비점막의 배세포의 점액 당단백을 관찰하기 위하여 5 μl 두께의 파리핀 절편을 AB/PAS염색을 시행하였다. 비점막의 상피 전체 면적과 AB/PAS으로 염색된 면적을 NIH image program(National Technical Information Service, Springfield, VA)을 이용한 반자동화 화상분석장치(semi-automatic image analysis system)를 사용하여 측정하였고, 자료는 전체 상피면적에 대한 AB/PAS으로 염색된 면적의 백분율로 계산하였다. 비중격 중심에서 비점막 상피 표면에 저장된 점액 당단백의 페센트 면적은 양쪽 비중격에서 각각 1 mm 이상에서 측정하였다.

MUC5AC mRNA 발현
   백서 MUC5AC의 320 bp cDNA 를 포함한 plasmid로부터 ³⁵S-labelled riboprobe를 만든다. Lee 등⁴⁾의 방법에 따라 동결절편을 ³⁵S-labelled riboprobes와 보합결합(hybridization)시킨 후 씻는다. 7~21일 동안 자가방사기록법으로 감광시킨 후 사진 유제(emulsion)에 현상시키고, hematoxlyin으로 대조 염색하였다.

통계학적 분석
   자료는 mean±SE으로 표시하였으며, 실험군들의 각 자료를 비교하기 위하여 ANOVA 방법으로 p value를 구하였으며, 5% 유의 수준에서 통계학적 분석을 하였다.

결     과

난알부민으로 감작된 백서에서 배세포의 형성
   대조군 백서의 경구개 절두유치 위치의 비중격 점막에서 AB/PAS으로 염색된 배세포는 거의 관찰되지 않았다(Fig. 1A). 그러나, 난알부민- 감작 백서에서는 AB/PAS으로 염색된 배세포가 관찰되었으며(Fig. 1B), AB/PAS-염색 면적이 유의하게 증가하였다(Fig. 2).

비중격 점막 상피에서의 EGFR 단백의 발현
   EGFR 항체를 이용한 면역조직화학적 염색에서 대조군에서는 EGFR 면역 염색 세포가 관찰되지 않았지만(Fig. 3A), 난알부민- 감작군에서는 배세포에서 양성 EGFR-면역염색이 관찰되었다(Fig. 3B).

MUC5AC mRNA의 발현
   MUC5AC mRNA 발현은 대조군에서는 관찰되지 않았지만(Fig. 4A), 난알부민- 감작 백서의 비점막 상피에서는 MUC5AC mRNA의 현저한 발현이 관찰되었다(Fig. 4B). 그러나 sense probe를 사용한 비점막 상피조직에서는 MUC5AC mRNA의 발현이 관찰되지 않았다.

EGFR tyrosine kinase 억제제가 점액 생성에 미치는 영향
   EGFR tyrosine kinase 억제제(BIBX1522)로 전처치한 군에서는 AB/PAS-염색 세포수가 감소하였고(Fig. 1C), AB/PAS-염색된 면적이 유의하게 감소하였다(Fig. 2). 또한 비점막 상피에서 MUC5AC mRNA의 발현이 현저히 감소하였다(Fig. 4C).

고     찰

   본 실험에서 난알부민으로 감작시킨 백서의 비점막 상피에서는 EGFR 단백이 발현되었고, MUC5AC mRNA가 현저히 증가하였으며, AB/PAS로 염색된 배세포 수가 증가하였다. 또한 EGFR에 특이한 tyrosine kinase 억제제로 전처치한 동물에서 배세포 및 MUC5AC점액 유전자의 발현이 현저히 감소하였다.
   생체상태에서 점액을 생성시키기 위하여는 여러 동물 모형이 이용된다. Shimizu 등⁷⁾은 백서에서 난알부민을 이용하여 알레르기 비염 모델을 만들어 비점막 상피에서 배세포의 증식과 이형성을 유발시켜 점액 생산을 유도하였다. 본 실험에서도 난알부민을 복강으로 투여하여 감작시킨 후 3일간 비강내 유반반응을 시행하여 점액 생산을 증가시켰다. 그러나 난알부민을 복강으로만 주사한 백서의 비중격 점막에는 유의한 배세포 수의 증가는 없었다.
   Berger 등⁸⁾⁹⁾은 알레르기 비염환자, 비알레르기 비염환자 및 정상 대조군 사이에서 하비갑개의 비점막에서 단위 면적당 배세포의 갯수는 차이가 없고 다만 알레르기 비염에서 점액 과분비는 배세포의 기능적인 활동의 증가에 기인한다고 보고하였고, Karlsson 등¹⁰⁾은 계절성 알레르기 비염 환자에서 자연적인 화분 노출은 배세포를 증가시키지 못한다고 보고하였다. 그러나 Gluck 등¹¹⁾은 계절성 알레르기 비염 환자의 세포진단 면봉 조직표본(cytology swab preparation)에서 배세포의 증식을 관찰하여 항원 노출에 의하여 배세포 증식에 의한 비점막의 과분비를 암시하였다.
   상피성장인자(epidermal growth factor, EGF로 약함)와 형질전환 성장인자- 알파(transforming growth factor α)는 세포막 단백인 EGFR에 결합하여 세포내에서 EGFR tyrosine kinase를 활성화시켜 세포의 증식과 분화를 일으킨다.¹²⁾ Takeyama 등³⁾은 인간 폐 점액표피양 암종세포(human pulmonary mucoepidermoid carcinoma cell line, NCI-H292)를 이용한 세포배양 실험에서 EGFR의 활성화는 점액 유전자의 발현과 배세포의 형성에 관여한다고 보고하였고, Lee 등⁴⁾은 기관지에서 agarose plug를 주입하여 유발한 배세포의 이형성에서 EGFR가 배세포의 형성에 중요하며, 특히 조직에 침윤된 중성구 등의 여러 염증 세포에서 분비되는 TNF는 EGFR의 발현을 증가시키고 활성화시켜 점액 생성을 유도할 수 있는 것으로 알려져 있으며,¹³⁾ 본 실험에서 EGFR의 발현도 알레르기 유발 반응후 침착된 호산구 등에서 TNF의 분비에 의한 것으로 생각된다. 또한 Takeyama 등¹⁴⁾은 NCI-H292 세포를 이용하여 기도 염증 반응에서 생산되는 산화성 스트레스(oxidative stress)는 배위자에 관계없이 EGFR를 활성화시켜 세포내에서 mitogen-activated protein kinase kinase(MEK)-p44/42 mitogen-activated protein kinase(p44/42 mapk) 등의 신호 전달체계를 통하여 점액 생성이 일어난다고 보고하였다.
   Shimizu 등⁶⁾은 난알부민으로 감작시킨 백서의 알레르기 비염 모델에서 비점막에서의 점액 생성은 cysteinyl leukotriene이 중요한 역할을 하지만, 알레르기 비염의 비점막에 특징적으로 침윤되는 호산구는 점액 생성에 중요한 역할을 하지 못한다고 보고하였다. 또한 지질다당질(lipopolysaccharide)로 유발한 점액 생성 모델에서 호중구와 사이클로옥게나지(cyclooxygenase)가 점액 생산에 중요한 역할을 한다고 하여 난알부민으로 유도된 점액 생산과 지질다당질으로 유도된 점액 생산의 기전은 다르다고 하였다. 그러나 Shimizu의 실험에서는 점액 생성 기전에 대한 세포내에서의 기전을 밝히지 못하였다. 지질다당질으로 유도되는 점액 생성이 세포내의 EGFR 활성과 관계되는지는 추후 연구가 되어져야 할 것으로 생각된다.
   알레르기 비염의 비점막에서 여러 점액 유전자가 발현된다.¹⁵⁾ EGFR의 활성은 배세포 형성 및 점액 유전(MUC5AC)의 생성에 중요하다. EGFR은 세포막에 있는 단백으로 EGFR에 특이한 tyrosine kinase의 활성을 통하여 신호 전달이 세포내로 전달된다. 본 연구에서는 백서 비점막에서 EGFR 활성이 점액 생성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 EGFR에 특이한 tyrosine kinase 억제제(BIBX1522)를 투여하여 백서의 비점막에서 배세포의 형성과 MUC5AC 점액 유전자의 생성을 억제하였다. 따라서 백서를 이용한 알레르기 비염 모델에서 비점막에서의 배세포 형성은 EGFR의 활성을 통하여 이루어짐을 관찰할 수 있었다.

결     론

   백서를 이용한 알레르기 비염 모델의 비점막에서 점액 생성은 EGFR의 활성과 관련이 있다. 따라서 알레르기 비염에서 점액의 발생 기전을 밝히는 것은 알레르기 비염 환자에서 점액 과분비에 대한 치료제를 개발하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.

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