교신저자：정종우, 138-736 서울 송파구 풍납동 388-1 울산대학교 의과대학 서울중앙병원 이비인후과학교실
                  전화：(02) 2224-3718 · 전송：(02) 489-2773 · E-mail：jwchung@amc.seoul.kr 

서     론

   음신호는 코티기관의 능동적인 물리학적 성질이 내유모세포에서 감지됨으로써 청신경을 통해 대뇌로 전달된다. 특히 내이의 감각세포인 외유모세포는 코티기관의 물리학적인 성질을 조절하며 이를 통하여 음신호전달과정을 조절한다.²⁾ 외유모세포의 신호전달은 세포내 Ca²⁺농도([Ca²⁺]_i)에 의해 미세하게 조절되는데,³⁾ [Ca²⁺]_i는 기본적인 세포의 기능을 수행하는데 중요한 역할을 한다. [Ca²⁺]_i의 증가는 대개 세포막의 Ca²⁺ 이온통로를 통한 유입이나 세포내 Ca²⁺ store에서 유리되는 Ca²⁺에 의해 생기는데,⁴⁾ 외유모세포에서는 전압의존성 Ca²⁺ 이온통로를 통한 Ca²⁺의 유입이¹⁾ Ca²⁺ 의존성 K^＋ 전류를 조절하고, 신경전달물질의 분비 등을 일으킨다. 또한 전기적인 자극이나, 고농도의 KCl 용액을 통하여 세포막을 탈분극시키면 전압의존성 Ca²⁺ 이온통로를 통한 Ca²⁺의 세포내 유입이 생기게 되며, 이는 세포내의 2차 신경전달물질을 활성화시키고, 단백질의 인산화를 촉진하여 각 효소체계를 작동시켜서 세포의 길이의 변화를 일으키고, 음감지능력을 변화시키게 된다.⁴⁾
   와우의 능동적인 물리적 기전은 원심성섬유에 의하여 조절되며, 원심성섬유를 자극하였을 때 외유모세포는 motile element로 인하여 cochlear amplifier로 작용하여 음신호의 감지와 특정주파수의 변별력을 증폭시키는 것으로 알려져 있다.⁵⁾ 원심성섬유의 자극에 의해 청신경의 compound action potential(CAP)인 N1이 감소되었고,⁶⁾ 내유모세포의 receptor potential이 감소되었으며,⁷⁾ Distortion product otoacoustic emission(DPOAE)이 감소하였다.⁸⁾ 외유모세포에는 주로 원심성섬유가 접합되어 있기 때문에 이 신경의 조절에 의해 외유모세포의 물리적 성질이 조절될 것으로 생각할 수 있다.
   이러한 원심성섬유의 신경전달물질로는 Acetylcholine(Ach), ATP 등이 있을 것으로 생각되며, 외유모세포에서 alpha-9형의 Ach 수용체의 발현에 의해⁹⁾¹⁰⁾ Ach에 의한 원심성 조절의 가능성을 알 수 있다. 더구나 내측 원심성 신경섬유에 의한 DPOAE의 저하는 nicotinic cholinergic receptor에 의해서 생기는 것으로 알려져 있어서¹¹⁾ cholinergic agent가 내측 원심성 신경섬유의 주요한 접합부위인 외유모세포를 조절하여 코티기관의 물리적성질을 조절할 것으로 추측할 수 있다. 실지로 Ach에 의해 외유모세포의 과분극이 생기며 이는 코티기관의 tuning property를 변화시킨다.¹²⁾ 또한 Ach은 외유모세포의 완만한 길이의 변화를 일으키는 것으로 알려져 있고,²⁾ 막전압의 변화에 따른 fast motility를 증폭시키는 것으로 보고되어,¹³⁾ 외유모세포에 미치는 Ach의 영향을 통하여 음전달과정의 조절이 이루어짐을 알 수 있다. 그러므로 원심성 섬유에 의하여 외유모세포의 물리적인 성질의 조절기전을 파악하기 위해서는 세포내의 2차 신호전달체계를 작동시키는 Ca²⁺ 농도의 조절에 관한 원심성 신경전달물질, 즉 Ach에 대한 연구가 필요하다.
   고농도의 KCl을 외유모세포에 투여하면 세포막을 통한 Ca²⁺의 유입에 의하여 세포내 Ca²⁺농도가 증가하는 것으로 알려져 있다. 이는 세포막의 탈분극에 의한 현상이며 이는 gentamicin이나 neonycin 등의 이독성 물질에 의하여 효과적으로 차단되는 것으로 보고되었다.¹⁴⁾ 즉, 세포막의 탈분극을 조절하는 기능에 의하여 외유모세포의 생리적인 조절기전이 영향받을 것임을 의미한다.
   그러므로, 본 연구에서는 기니픽 외유모세포에서 Ach에 의한 세포내 Ca²⁺농도의 변화와 세포막 탈분극에 의한 [Ca²⁺]_i의 증가에 미치는 Ach의 영향을 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

외유모세포의 분리
   백색 기니픽(200~250 g)에 sodium pentobarbital(50 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취시킨 후 양측의 측두골을 얻었다. Hank's balanced salt solution(HBSS：1.25 mM CaCl₂, 5.55 mM glucose, 0.81 mM MgSO₄, 0.44 mM KH₂PO₄, 136.9 mM NaCl, 0.34 mM Na₂HPO₄, 5.4 mM KCl, 5.0 mM HEPES, 300 mOsm, pH 7.4；GibcoBRL, USA) 용액내에서 중이강을 열고 와우를 노출시키고, 와우골포를 제거한 후 코티기관를 꺼내어 1 mg/ml의 collagenase IV(Sigma, USA)로 10분간 처리한 후 pipet으로 흡인, 배출하여 외유모세포를 분리하였다. 분리된 외유모세포를 50 μl의 HBSS 용액이 포함된 35 mm 배양용기에 넣어 약 20분간 세포가 바닥에 붙도록 기다렸다. 분리된 세포중 세포의 모양이 실린더 모양이고, 핵이 세포의 기저부에 위치하며, 세포의 첨부표면에 유모가 있는 것을 관찰하여 외유모세포임을 확인하였다(Fig. 1).¹⁵⁾

세포내 Ca²⁺농도의 측정
   35 mm 배양용기 밑에 구멍을 뚫고 유리슬라이드를 붙인 후 분리된 외유모세포를 부착시켰다. Fluo-3/AM(Molecular Probes, USA) 형광염색액 5 mM을 20분간 loading하고 씻어낸 후 정상 HBSS 용액으로 배양용기를 채우고 485 nm의 빛으로 자극하여 세포로부터 방사되는 520 nm의 형광을 측정하였다.
   Fluo-3/AM이 포함된 세포를 epifluorescence system이 부착된 도립현미경(Leitz Fluovert FS, Germany) 하에서 이에 부착된 CCD camera를 이용하여 실시간으로 관찰하였다. Photobleaching을 방지하기 위하여 세포를 자극하는 빛을 neutral density filter를 이용하여 97.5% 감쇄시켰다. 본 연구의 최장실험시간인 5분내에 photobleaching은 보이지 않았다. 세포에서 방출되는 형광은 Silicon Intensified Target 카메라(SIT-66, Dage-MTI Inc., USA)를 이용하여 관찰하였고, Axon Workbench 2000 소프트웨어(Axon Instrument Inc., USA)를 이용하여 분석하였다. 각 이미지는 32개의 연속된 프레임의 평균으로 만들었으며, 각 이미지는 평균 1.066초마다 관찰되었다.
   측정된 세포내의 fluo-3의 형광치를 F라고 하였을 때 다음과 같은 식으로부터 Ca²⁺ 농도를 구할 수 있다.

                               F- F_min
   [Ca²⁺]_free＝Kd × ------
                              F_max- F
 
   Kd는 fluo-3/calcium complex의 dissociation constant이고, F_max는 세포에서 측정된 최대 형광값, F_min은 최소형광값이다. In vitro calibration과 in vivo calibration을 통해 Fluo-3의 Kd, F_max, F_min을 구하였다.¹⁶⁾¹⁷⁾ 얻어진 값은 Kd＝218.7(nM), F_max＝199, F_min＝16이었다. In vitro calibration에 이용된 세포들의 평균 휴식기 [Ca²⁺]_i는 140.2±35.0(nM)(n＝12)이었다.
   본 연구에서는 세포의 분리 및 fluo-3 loading 후 세포의 휴식기 [Ca²⁺]_i가 70부터 210(nM)의 범위는 있는 안정적인 세포들만 실험하였다.

외유모세포에 대한 자극
   50 μl의 HBSS 용액에 있는 외유모세포에 tip의 직경이 5 μm인 borosilicate glass micropipette(μtip)와 pneumatic picopump(WPI Inc., USA)를 이용하여 KCl을 투여하였고, micropipette tip은 외유모세포에서 50 μm 가량 떨어진 곳에 위치하였다.
   각각의 자극이 주어진 후 형광의 변화를 통하여 [Ca²⁺]_i의 변화를 관찰하였다. Carbamylcholine과 choline chloride는 각 1 mM의 농도로 HBSS에 희석하고 위의 자극을 주기 전 최소 20분가량 전처치하였다.

통계처리
   각 자료는 Mean±SEM으로 표시하였고, 각 군간의 차이는 t-test를 이용하였으며(Primer of Biostatistics, ver 4.0, McGrow Hills, USA), p value가 0.05이하일 때 의미있는 차이라고 분석하였다.

결     과

외유모세포내 Ca²⁺의 농도
   분리한 후 HBSS 용액내에서 정상모양의 외유모세포의 [Ca²⁺]_i는 평균 143.7±6.3 nM이었다(n＝77). 1 mM의 carbamylcholine이 포함된 HBSS 용액에서 약 20분간 incubation한 후 실험에 이용한 외유모세포의 [Ca²⁺]_i는 평균 157.6±6.2 nM이며(n＝56), 1 mM의 choline Cl가 포함된 HBSS에서는 20분이 경과한 후 138.6±7.5 nM로(n＝48) 각 조건간의 큰 차이를 보이지 않았다(p>0.05).

Carbamylcholine의 투여에 의한 [Ca²⁺]_i의 변화
   1 mM carbamylcholine을 5 μm 직경의 pipet을 통하여 30초간 투여하였을 때 14개의 세포중 9개의 세포에서 약 27.4%의 [Ca²⁺]_i의 증가를 나타내었다(n＝9). HBSS와 1 mM choline Cl를 같은 방법으로 투여하였을 때는 각각 4.6%, 4.5%의 증가를 나타내어 carbamylcholine투여에 의하여 유의한 증가를 나타내었다(Fig. 2).

KCl 자극에 의한 세포내 Ca²⁺ 농도의 증가
   자극전 상태의 평균 [Ca²⁺]_i는 112.8±13.3 nM이었고, 150 mM KCl 용액을 5 μm의 tip을 통하여 30 kPa의 압력으로 20초간 투여하였을 때 [Ca²⁺]_i는 230.3±31.8 nM로 증가하여(n＝9) 약 106%의 증가를 나타내었다(Fig. 3).
   [Ca²⁺]_i는 자극시작 직후부터 증가하기 시작하여 자극후 약 28.1±1.2초후에 최고치에 이르렀고 서서히 감소하기 시작하여 자극 98.0±7.0초후에 자극전의 상태로 돌아왔다.

KCl 농도의 변화에 따른 [Ca²⁺]_i의 변화
   KCl 농도를 5.4 mM(HBSS)부터 25, 50, 75, 100, 150 mM로 증가시켜서 외유모세포를 자극하였을 때 [Ca²⁺]_i의 최고치는 자극전에 비하여 각각 4.6%, 13.3%, 37.7%, 63.4%, 65.4% 및 106.3% 증가하였다(Fig. 4). 자극전의 [Ca²⁺]_i와 비교하여 보았을 때 25 mM KCl 이상의 농도자극에서부터 통계적으로 유의한 증가를 보였다. 5.4 mM KCl부터 150 mM의 KCl의 자극시 전반적으로 sigmoidal curve의 모양을 보였으며 100 mM이상의 자극시 급격한 증가를 보였다.

KCl 자극에 대한 carbamylcholine과 choline Cl의 영향
   1 mM의 carbamylcholine이 포함된 HBSS용액내에서 세포를 약 20분간 incubation한 후 KCl 자극에 의한 [Ca²⁺]_i의 증가 %는 각각 10.1%, 24.9%, 43.3%, 52.6%, 80.5%, 105.9%였고, 1 mM choline Cl가 포함된 HBSS용액내에서는 각각 9.5%, 26.2%, 40.8%, 78.9%, 104.6%, 114.6%로 정상 HBSS 용액에서와 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 5). [Ca²⁺]_i의 절대증가치도 각 농도별로 세 가지 조건 사이에 통계적으로 유의한 차이는 보이지 않았다(t-test, p>0.05).

고     찰

   Acetylcholine(Ach)은 원심성 신경의 중요한 신경전달물질이며 외유모세포의 신경접합부에서 분비될 것으로 여겨진다. Carbamylcholine은 choline esterase에 의하여 분해되지 않는 non-selective cholinergic agonist이다.
   본 연구에서는 carbamylcholine에 의해 [Ca²⁺]_i의 증가를 관찰하여 원심성 신경섬유의 작용이 [Ca²⁺]_i를 통해서 이루어짐을 알 수 있었다. Nicotine과 muscarine의 길항제를 이용한 연구에서는 와우의 원심성섬유를 통한 반응이 억제되었고,¹⁸⁾ Ach은 외유모세포내의 [Ca²⁺]_i를 증가시키며¹⁹⁾ 또한 Ach에 의하여 fast motility가 변화되었다.¹³⁾ 이러한 사실들을 통하여 Ach이 와우 코티기관의 물리적 성질을 능동적으로 조절할 것으로 여겨지는 외유모세포에서 [Ca²⁺]_i 조절, 세포내 2차전달물질의 활성도조절, 길이의 변화조절등을 일으킬 것으로 여겨진다.
   외유모세포에서는 주로 alpha-9형의 Ach 수용체가 존재하며⁹⁾ muscarine이나 nicotine에 의해서는 오히려 반응이 억제되는 특징을 가지고 있다. 또한 코티기관에 α9과 더불어 α7 receptor subunit의 발현도 보고되었다.²¹⁾ Ach에 의해 [Ca²⁺]_i증가에 관하여는 아직 상반되는 결과들이 있지만,¹³⁾¹⁹⁾ 세포의 전체범위의 형광치를 평균내어 분석하는 일반적인 실험방법으로는 Ca²⁺의 국소적인 증가를 정확히 관찰하기 어려운 단점을 가지고 있다. Confocal microscopy을 이용한 연구에서는 Ach에 의하여 세포의 일부분에 국한되어 Ca²⁺의 증가를 관찰할 수 있었다.²⁰⁾ 각 세포막에 분포하는 Ach 수용체의 발현양상이 여러 조건에 따라 다르기 때문에 나타날 수 있으며,²²⁾ 본 연구에서는 대상세포 중 약 65%에서만 증가를 보이기는 하였지만 Ach 수용체의 발현정도가 각 세포마다 다를 것으로 생각되며, 효소와 기계적인 자극을 통해 세포를 분리하는 과정을 통해 세포의 손상을 무시할 수 없을 것이다. 삼투압농도에 의하여 [Ca²⁺]_i의 변화가 생기기도 한다. Doi와 Ohmori의 연구 19에서는 1 M의 Ach을 사용하였는데, 1 M의 Ach은 2,000 mOsm 이상의 삼투압농도를 가지게 된다. 삼투압농도의 변화에 따라 [Ca²⁺]_i의 변화가 일어나게 되므로 이들의 연구에서 삼투압농도의 변화에 의한 [Ca²⁺]_i의 증가가능성을 배제할 수 없다. Carbamylcholine도 Ach와 마찬가지로 농도에 따라 삼투압농도의 변화를 초래하는데, 300 mOsm의 HBSS에 1 mM의 carbamylcholine를 첨가하였을 때 약 302 mOsm의 삼투압 농도로 큰 영향을 미치지 않는다. 그리고 동일한 농도의 Choline Cl의 자극(302 mOsm)에 의해서도 [Ca²⁺]_i의 변화가 없었기 때문에 이는 carbamylcholine에 의한 직접적인 [Ca²⁺]_i의 증가라고 생각할 수 있다.
   외유모세포에서 Ach에 의해 세포막전압이 과분극되는 현상이 기니픽에서 보고되었다.²³⁾ Ach에 의한 전류는 Ach에 의해 활성화된 이온통로를을 통하여 Ca²⁺의 유입이 생기고 이는 Ca²⁺-activated K^＋ current를 유도하여 생길 것으로 생각된다. 그러나 Ach 수용체가 GTP-binding protein과 연결되어 있어서 muscarinic 수용체의 존재가능성도 있다.²³⁾ Elgoyhen 등⁹⁾이 성질을 밝힌 αa 9형의 Ach수용체는 실지로 nicotinic과 muscarinic성질을 모두 가지고 있는 수용체이며, 와우의 외유모세포에 존재하므로,¹⁰⁾ 본 연구에서 carbamylcholine에 의한 [Ca²⁺]_i의 증가는 Ca²⁺ channel을 통한 Ca²⁺의 유입과 세포내 Ca²⁺ store에서의 Ca²⁺ release 기전이 모두 관여하는 것으로 생각할 수 있다.²⁴⁾ 결국 원심성섬유자극을 통한 외유모세포의 조절기전에 [Ca²⁺]_i이 관여하리라는 가설을 가능케 한다.
   [Ca²⁺]_i 증가에 의한 세포의 생리적 변화는 아직 확실히 밝혀져 있지 않다. 우선 Ca²⁺-dependent K^＋ conductance의 변화로 인한 세포막의 과분극을 생각할 수 있다.²³⁾ 외유모세포는 과분극되었을 때 세포의 길이의 신장이 일어나서 코티기관의 물리적 성질의 변화를 초래한다.²⁾ 또한 외유모세포의 세포막전압-길이변환공식(voltage-to-length change conversion function, δL-V)은 non-linear하여 세포막이 과분극될 수록 δL-V공식의 기울기가 감소한다.²⁵⁾ 즉, 과분극될수록 electromotility는 감소한다. 결국 Ach은 외유모세포의 electromotility는 감소시키며, 이는 원심성섬유의 억제작용과 잘 연관된다. 그러나 microchamber를 이용한 연구에서는 Ach에 의하여 electromotility의 이득의 증가를 보고하여 서로 상반된 결과를 보여주고 있다.²⁶⁾ 이는 nicotinic과 muscarinic 성질을 다 가지고 있는 Ach 수용체의 특성때문이라고 생각할 수 있으며, 각각이 서로 다른 형태의 생리적 효과를 가진다고 생각할 수 있다. 이는 앞으로 더 연구하여야 할 과제이다.
   고농도의 KCl에 의한 [Ca²⁺]_i의 증가는 세포막의 탈분극에 의한 Ca²⁺ 이온통로를 통해 이루어진다.¹⁷⁾ 본 연구에서 5.4, 25, 50, 75, 100, 150 mM의 KCl으로 자극하였을 때 세포내 Ca²⁺ 농도가 점점 증가하여 전체적으로 sigmoidal curve를 보인다(Fig. 3). 이는 K^＋을 통한 세포막 전위차이가 크면 클수록 Ca²⁺ influx가 더 많이 생겼기 때문일 것이다. Carbamylcholine과 choline Cl로 전처치한 경우에도 마찬가지였으며, 각 KCl의 자극농도에서 carbamylcholine과 choline Cl 전처치에 의한 차이는 없었다. 이는 1 mM의 carbamylcholine이 탈분극으로 인해 활성화된 Ca²⁺ 이온통로에 영향을 미치지 않음을 의미한다. 다른 농도의 carbamylcholine를 실험해 보지는 않았으나 더 높은 농도의 carbamylcholine는 삼투압농도의 변화가 초래되므로 1 mM 정도가 자극 가능한 가장 높은 농도로 생각된다.
   본 연구에서 20분간의 carbamylcholine 전처치 후 전처지하지 않은 군과 비교하여 고농도의 K^＋ 자극에 의한 [Ca²⁺]_i가 차이가 없었다. 고농도의 K^＋을 이용한 외유모 세포막전위의 변화에 대해 carbamylcholine이 아무런 영향을 미치지 않음은 Ach 수용체 자극에 의한 세포막전위의 과분극현상과 서로 상충되는 결과이다. 정상적인 세포에서는 carbamylcholine에 의한 국소적인 Ca²⁺의 증가는 세포막의 Ca²⁺ pump, 세포내 Ca^＋ storage 기전 등으로 다시 원상태로 회복된다. 본 연구의 결과도 carbamylcholine의 전처치가 [Ca²⁺]_i와 세포막전위에는 영향을 미치지 않음을 보여주고 있다.

   Carbamylcholine에 의한 세포내 2차 전달물질체계의 활성화의 가능성도 있으나,²⁴⁾ 본 연구에서 K＋농도에 따른 [Ca²⁺]_i의 변화곡선이 carbamylcholine의 처치전후에 차이를 보이지 않으므로 carbamylcholine이 다른 자극에 의한 [Ca²⁺]_i의 변화를 미세하게 조절하는 영향은 없다고 생각할 수 있다.

결     론

   이와 같은 결과로 미루어 보아 외유모세포의 신경접합부에서 분비되는 Ach은 국소적으로 [Ca²⁺]_i를 증가시켜서 조절역할을 할 것으로 생각되며, 세포막의 탈분극에 의한 세포의 Ca²⁺ 유입에 따른 [Ca²⁺]_i의 증가기전에는 영향을 미치지 못할 것으로 생각된다.

1. Chung JW, Kim CS. Changes of the Ca²⁺ current of the cochlear outer hair cells by cisplatin in guinea pigs. Korean J Otolaryngol 1998;41:553-8.

2. Brownell WE, Bader CR, Bertrand D, Ribaupierre Y. Evoked mechanical response of isolated cochlear hair outer hair cells. Science 1985;277:194-6.

3. Jaramillo F. Signal transduction in hair cells and its regulation by calcium. Neuron 1995;15:1227-30.

4. Wangemann P, Schacht J. Homeostatic mechanisms in the cochlea. In: Dallos P, Popper AN, Fay RR, editors. The cochlea. New York: Springer-Verlag New York, Inc.;1996. p.130-46.

5. Dallos P, Evans BN. High-frequency motility of outer hair cells and the cochlear amplifier. Science 1995;267:2006-9.

6. Gifford ML, Guinan JJ Jr. Effects of electrical stimulation of medial olivocochlear neurons on ipsilateral and contralateral cochlear responses. Hear Res 1987;29:179-94.

7. Brown MC, Nuttall AL. Efferent control of cochlear inner hair cell responses in the guinea pig. J Physiol 1984;354:625-46.

8. Mountain DC. Changes in endolymphatic potential and crossed olivocochlear bundle stimulation alter cochlear mechanics. Science 1980;210:71-2.

9. Elgoyhen AB, Johnson DS, Boulter J, Vetter DE, Heinemann S. Alpha 9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell 1994;79:705-15.

10. Park H-J, Niedzielski AS, Wenthold RJ. Expression of the nicotinic acetylcholine receptor subunit, α9, in the guinea pig cochlea. Hear Res 1997;112:95-105.

11. Kujawa SG, Glattke TJ, Fallon M, Bobbin RP. A nicotinic-like rerceptor mediates suppression of distortion otoacoustic emissions by contralateral sound. Hear Res 1994;74:122-34.

12. Art JJ, Fettiplace R, Fuchs PA. Synaptic hyperpolarization and inhibition of turtle cochlear hair cells. J Physiol 1984;356:525-50.

13. Dallos P, He DZZ, Sziklai I, Mehta S, Evans BN. Acetylcholine, outer hair cell electromotility, and the cochlear amplifier. J Neurosci 1997;15:2212-28.

14. Dulon D, Zajic G, Aran JM, Schacht J. Aminoglycoside antibiotics impair calcium entry but not viability and motility in isolated cochlear outer hair cells. J Neurosci Res 1989;24:338-46.

15. Zajic G, Schacht J. Comparison of isolated outer hair cells from five mammalian species. Hear Res 1987;26:249-56.

16. Minta A, Kao Y, Tsien RY. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem 1989;264:8171-8.

17. Dulon D, Zajic G, Schacht J. Increasing intracellular free calcium induces circumferential contractions in isolated cochlear outer hair cells. J Neurosci 1990;10:1388-97.

18. Bobbin RP, Konish T. Action of cholinergic and anticholinergic drugs at the crossed olivocochlear bundle-hair cell junction. Acta Otol 1974;77:56-65.

19. Doi T, Ohmori H. Acetylcholine increases intracellular Ca²⁺ concentration and hyperpolarizes the guinea-pig outer hair cells. Hear Res 1993;67:179-88.

20. Blanchet C, Erostegui C, Sugasawa M, Dulon D. Acetylcholine-induced potassium current of guinea pig outer hair cell: its dependence on a calcium influx through nicotine-like receptors. J Neurosci 1996;16:2574-84.

21. Morley BJ, Li HS, Hiel H, Drescher DG, Elgoyhen AB. Identification of the subunits of the nicotinic cholinergic receptors in the rat cochlea using RT-PCR and in situ hybridization. Mol Br Res 1998;53:78-87.

22. Oshima T, Ikeda K, Furukawa M, Ueda N, Suzuki H, Takasaka T. Distribution of Ca²⁺ channels on cochlear outre hair cells revealed by fluorescent dihydropyridine. Am J Physiol 1996;271:C944-9.

23. Kakehata S, Nakagawa T, Takasaka T, Akaike N. Cellular mechanism of acetylcholine induced response in dissociated outer hair cells of guinea-pig cochlea. J Physiol (Lond) 1993;463:227-44.

24. Niedzilski AS, Ono T, Schacht J. Cholinergic regulation of the phosphoinositide second messenger system in the guinea pig organ of Corti. Hear Res 1992;59:250-4.

25. Santos-Sacchi J. Asymmetry in voltage dependent movements of isolated outer hair cells from the organ of Corti. J Neurosci 1989;9:2954-62.

26. Sziklai L, Dallos P. Acetylcholine controls the gain of the voltage-to-movement converter in isolated outer hair cells. Acta Otolaryngol 1993;113:326-9.