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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 44(2); 2001 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2001;44(2): 177-183.
DISC-GMCSF (GM-CSF Gene Transduced Defective Infectious Single Cycle Herpes Virus) Gene Therapy in the Established SCCVII squamous cell carcinoma model.
Se Heon Kim, Eun Chang Choi, Won Pyo Hong, Hyun Chul Yoon, Jong Seok Oh
Department of Otorhinolaryngology, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea .shkimmd@yumc.yonsei.ac.kr
GM-CSF 유전자를 이입시킨 DISC바이러스(Defective Infectious Single Cycle Herpes Simplex Virus)의 종양내 투여를 이용한 두경부 편평세포암 모델의 유전자 치료
김세헌 · 최은창 · 홍원표 · 윤현철 · 오종석
연세대학교 의과대학 이비인후과학교실
주제어: 두경부 편평세포암종유전자 치료DISC 바이러스.
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Over the past five years, preclinical studies evaluating viral-vector-mediated gene transfer in the treatment of head and neck cancer have reported promising results. The main goal of this study was to evaluate the efficacy of intra-tumoral treatment with DISC virus (defective infectious single cycle herpes virus) carrying a GM-CSF immunomodulatory genes as cancer gene therapy.
MATERIALS AND METHOD:
Using the SCCVII squamous cell carcinoma model, we determined the in vivo GM-CSF production by ELISA method and evaluated the in vivo effects of DISC-GMCSF on the established tumor model. One of the following preparations was injected every two days to a total of three-doses intratumorally: group I (control): PBS alone, group II: heat inactivated DISC-GMCSF, group III: DISC-GMCSF. To prove the specific anti-tumor response, we analyzed the surface phenotype of tumor infiltrating cells. A flow cytometric analysis was performed using FACScan.
RESULTS:
Clinically relevant gene transfer could be possible by direct injection of tumors in situ. Intratumoral injection of the DISC-GMCSF (GM-CSF gene transduced defective infectious single cycle herpes virus) resulted in effective in vivo production of cytokines (4,500 pg/0.5 g tumor tissue), but as the progeny of the DISC virus could not be infected by other host cells, the effective cytokine production time seems limited. However, the DISC vector was safe and also allowed to be administered repeated treatments as needed. Effects of DISC-GMCSF injection on tthe established syngeneic tumor model showed the greatest inhibition of tumor growth in the DISC-GMCSF treated group (control vs DISC-GMCSF, p<0.01). In contrast to this, heat inactivated DISC-GMCSF showed no significant tumor suppression effect. It was interesting to note from our in vivo analysis of tumor infiltrating cells that treatment of flank tumors with the DISC-GMCSF virus resulted in a significant increase in the percentage of CD8 positive cells within the tumor (control vs DISC-GMCSF, p<0.05).
CONCLUSION:
Intratumoral injection of DISC-GMCSF significantly suppressed the tumor growth in established tumor model and induced intratumoral increase in immune effector cells. The results not only confirmed clinically relevant gene transfer but also demonstrated the gene transfer to be an effective anti-cancer therapy.
Keywords: DISC virusGM-CSFGene therapyTumor vaccineHead and Neck cancer

교신저자:김세헌, 135-720 서울 강남구 도곡동 146-92 연세대학교 의과대학 이비인후과학교실
                  전화:(02) 3497-3463 · 전송:(02) 3463-4750 · E-mail:shkimmd@yumc.yonsei.ac.kr

서     론


   진행된 두경부 편평세포암의 예후는 기존의 수술 및 방사선요법의 발달에도 불구하고, 5년 생존율이 30% 미만으로 크게 개선되지 않은 상태이다. 아울러 기존의 치료법들은 치료 후 음성, 저작과 연하장애 등을 초래하는 경우가 많으므로 삶의 질적 측면에서 볼때 새로운 효과적인 치료법의 개발이 요구된다.1)
   Clayman 등이 종양억제 유전자인 p53 유전자를 아데노바이러스에 이입 시킨 후 종양내 주사시 종양의 치료효과를 보고한 이래 최근 두경부 편평세포암의 새로운 치료법으로 바이러스를 유전자 전달 매개체로한 유전자 치료가 새롭게 각광 받고있으며, 좋은 결과를 보여주고 있다.2)3)4) 지금까지 보고된 유전자 치료전략은 크게 5가지로 구분된다. 첫째로는 종양에 대한 면역반응을 강화시키는 전략으로 이제까지 보고된 유전자 치료전략의 과반수 이상을 차지하고 있으며, 방법은 종양내로 원하는 유전자를 직접 전달하는 in vivo방법과, 종양을 채취하여 배양상태에서 원하는 유전자를 이입시킨 후 다시 주입하는 ex vivo방법이 있다. 그 외로는 종양억제유전자를 이용하는 방법, 전구약물과 반응하여 세포독성을 유발할 수 있는 자살유전자 요법, 항암치료약물에 내구성을 갖는 유전자를 환자의 조혈세포에 이입시키는 방법, 발암유전자를 무력화시켜 발현을 차단하는 방법 등이 있다.5) 이제까지 많은 항종양 면역치료법이 시도되었으나 만족할 만한 결과를 보이지 못하였다. 그러나 그 원인은 종양항원이 존재하지 않아서라기보다는 효과적인 항종양 반응을 유발하지 못해서라고 생각하며6) 따라서 항종양효과를 더욱 높이기 위해 유전자 치료전략 중 종양에 대한 면역반응을 강화시키는 연구가 활발히 진행되고 있다. 최근 헤르페스바이러스를 유전자 전달 매개체로 하는 연구가 활발히 진행중이며 이것은 기존의 다른 유전자 전달 매개체 보다 많은 장점을 지니고 있다. 우선 분열하는 세포뿐만 아니라 미분열상태에있는 세포에도 효율적으로 감염을 일으키며, 숙주세포에 감염되는 시간이 수시간 이내로 매우 짧고, 감염률도 타 방법에 비하여 매우 높다. 또한 유전자의 크기가 크기 때문에(150 Kb) 원하는 유전자의 이입에 제한이 적다는 장점들이 있다.7)8)
   본 연구는 헤르페스바이러스의 단백질막을 형성하는 부분의 유전자(gH)를 삭제시킨 유전적으로 변형된 DISC 바이러스(defective infectious single cycle herpes simplex virus) 를 유전자 전달 매개체로 사용하였다. 이 바이러스는 원래 헤르페스 감염에 대한 백신으로 만들어진 것으로 그 특성상 숙주 세포에 감염되어 증식되나 그 후손들(progeny)은 감염능력이 상실되어 다른 세포에 감염될 수 없다는 특징이 있다.9)10) 저자 등은 DISC 바이러스를 이용하여 종양세포에 GM-CSF유전자를 이입시킨 종양백신의 우수한 항암효과를 경험하였다. 그러나 이러한 종양백신의 치료는 종양의 부피가 작은, 즉 미세잔존암이나 미세전이가 있을 때 효과적이며 수술적 완전 절제가 불가능한 진행된 종양에서는 종양조직내로 원하는 유전자의 직접 이입이 더욱 효과적이라 생각된다.
   본 실험의 목적은 종양조직을 인위적으로 만들어, 선행 실험에서 가장 효과적인 면역조절유전자인 GM-CSF 유전자가 이입된 DISC 바이러스를 종양내 직접 주사 후 종양내 GM-CSF의 발현 및 종양증식의 억제성을 조사하고, 종양 조직내 GM-CSF에 의한 특이적 면역반응을 규명함으로서 궁극적으로는 진행된 두경부 편평상피암종에 있어서 면역조절 유전자를 이입시킨 DISC 바이러스를 이용한 유전자 치료의 가능성을 보고자 하였다.

재료 및 방법

실험 동물
  
동물군은 6 내지 8주된 암컷 C3H/HeJ(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)종의 생쥐를 병원균이 없는 적당한 조건에서 사육하여 8~10주 정도의 연령에서 실험에 사용하였다. 종양 모델은 SCC VII 세포주를 이용하여 측배면에 만들었는데, 이 모델은 두경부편평세포암과 매우 흡사한 생물학적 특성과 면역성을 지닌 종양 모델이다.11)

세포주 배양
   SCC VII 세포주는 Memorial Sloan-Ketterin Cancer Center에서 기증 받았으며 이것은 C3H/HeJ종 쥐에 자연 발생한 표피의 편평세포암이다. 세포주의 종양 발생능력을 극대화시키기 위해 세포주를 실험동물에 주사해 종양을 유발시킨 후 멸균하 조건에서 종양을 적출 하여, 콜라겐아제(collagenase)로 효소분해 시킨 후 세포를 채취하여 사용하였다. 배지는 10% 소의 태아 혈청(FCS)이 포함된 MEM(minimal essential media) 배지를 사용하였으며, 37°C, 5% CO2 환경 하에, 주당 2회 계대배양 하였고, 3회 계대배양(P3)에서 12회 계대배양(P12) 사이의 세포를 사용하였다.

DISC 바이러스 벡터의 생성
   HSV-2 strain HG52중 glycoprotein H(gH)-deleted HSV-2 바이러스(DISC)를 분리하여, gH를 생성하는 monkey kidney cell 의 일종인 Vero 세포주(CR1) 에서 증식시킨 다음 IL-2 및 mGM-CSF유전자를 PIMR3 벡터를 이용하여 HSV-2 strain HG52의 gH 유전자 부분에 삽입하였다.12) 삽입된 GM-CSF 유전자는 CMV early promotors의 조절 하에 발현되도록 하였다(DISC-GMCSF). 바이러스의 정량화는 CR1 세포주에서의 플라크형성단위(plaque forming unit(pfu)) 에 근거하여 시행하였으며 사용할 때까지 -80°C에 보관하였다.

종양조직내 DISC 바이러스의 표식 유전자 발현(X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) 염색)
  
DISC-LacZ 바이러스는 표지 유전자인 LacZ 유전자가 gH 유전자 부분에 삽입되어 있으므로, 바이러스에 감염된 종양세포에서 X-gal 염색을 통하여 간접적으로 바이러스의 종양세포 감염 정도를 분석할 수 있다. C3H/HeJ mice의 측배부에 1×106개의 SCC VII 세포를 피하 주사하여 종양을 형성하였다. 종양 세포 주입후 7내지 10일이 되면 종양 조직의 직경이 1 cm 정도 되며, 이때 실험 동물을 무작위로 두 그룹으로 나누어 대조군은 인산완충생리식염수용액을 실험군은 1×106 pfu의 DISC-LacZ 바이러스를 종양 조직내로 주입하였다. 24시간 후 종양조직을 채취해 냉동 절편하여 1% glutaraldehyde로 고정시킨 후 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside;Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA) 용액에 2시간 배양 염색하여 대조군과 비교하였다.

종양조직내의 GM-CSF 생산
  
C3H/HeJ mice의 측배부에 1×10 6개의 SCC Ⅵ 세포를 피하 주사하여 종양을 형성하였다. 종양 최대축의 길이가 0.5~1 cm 사이인 동물을 무작위로 다음과 같이 3군으로 나누었다(n=6/group). 제 1 군(제 1 대조군):인산완충생리식염수 치료군, 제 2 군(제 2 대조군):열처리한(70°C×5 min) DISC-GMCSF 1×107 pfu로 치료한 군, 제 3 군:DISC-GMCSF 1×10 7 pfu로 치료한 군. 각 군에 따라 생리식염수, 열처리한 DISC-GMCSF, 또는 DISC-GMCSF를 종양내 주사한 후 24시간, 48시간 및 72시간에 각 군에서 종양을 채취하여 1 ml의 용해완충액을 가한 뒤, 호모게나이저(PowerGen 125, Fisher scientific®)를 사용하여 조직을 균질화 하였다. 이것을 300 g로 6분간 원심 분리한 후, 상층액을 채취하여 영하 80°C에 보관 후 ELISA 방법(cat.#MGM00, R & D systems® Minneapolis, MN)을 이용하여 조직내 GM-CSF 생산 농도를 측정하였다.

DISC-GMCSF를 종양내 직접 투여시 항암 효과
   8~10주 연령의 25~30 g 사이의 C3H/HeJ mice를 사용하였다. 실험 동물의 양측 측배면에 1×106개(vol.=50μl)의 SCC VII 세포를 피하주사 하였다. 5일 후 대부분의 실험동물에서 종양의 최대 축이 0.5 cm 정도 성장하였을 때 종양의 최대축 길이가 0.4~0.6 cm 사이의 동물을 선별하여, 무작위로 12마리씩 3군으로 나누었다. 각 군은 다음과 같다. 제 1 군(제 1 대조군):인산완충생리식염수 치료군, 제 2 군(제 2 대조군):열처리한(70°C×5 min) DISC-GMCSF 1×107 pfu로 치료한 군, 제 3 군:DISC-GMCSF 1×107 pfu로 치료한 군(vol.=50μl). 각 군에 따라 생리식염수, 열처리한 DISC-GMCSF, 또는 DISC-GMCSF를 2일 간격으로 3회 종양내 주사 하였다. 1주일에 3회 간격으로 실험동물의 종양 생성 및 생성된 종양의 크기를 자로 측정하였으며, 종양의 부피는 타원구의 최대 장축 반지름 길이를 측정하여 ‘a’라하고 여기에 직각이 되는 축의 반지름을 ‘b’라고 하였을 때 4/3πab2로 계산하여 측정하였다.18)

종양조직내 CD4, CD8, 및 CD45 양성 세포의 침윤
   C3H/HeJ mice의 측배부에 1×106개의 SCC VII 세포를 피하 주사하여 종양을 형성하였다. 종양 최대축의 길이가 0.5~1 cm 사이인 동물을 무작위로 다음과 같이 3군으로 나누었다(n=3/group). 제 1 군(제 1 대조군):인산완충생리식염수 치료군, 제 2 군(제 2 대조군):열처리한(70°C×5 min) DISC-GMCSF 1×107 pfu로 치료한 군, 제 3 군:DISC-GMCSF 1×107 pfu로 치료한 군. 각 군에 따라 생리식염수, 열처리한 DISC-GMCSF, 또는 DISC-GMCSF를 2일 간격으로 3회 종양내 주사 하였다. 마지막 치료후 7일째 종양을 적출 하여, 종양조직내 침윤된 임파구의 세포표면 항원을 분석하였다. 적출된 종양조직을 잘게 조각 내어 콜라게나제(collagenase, 0.1%)로 37°C에서 45분간 처리 후 인산완충생리식염수(PBS)로 세척하였다. 1×106개의 세포를 채취하여 폴리에틸렌 관(polystylene tube)에 담고 다시 PBS와 섞어 원심분리(300 g×6분) 하여 3회 세척하였다. 세포는 FICT 또는 PE가 붙어있는 anti-murine CD-4[Pharmigen, San Diego, CA. USA](1:100), anti-murine CD-8 [Pharmigen, San Diego, CA. USA](1:100), 및 anti-murine CD-45 [Pharmigen, San Diego, CA. USA](1:100) 단일 항체와 섞은 후 4°C에서 30분간 배양하였다. PBS와 섞어 원심분리(300 g×6분)하여 3회 세척후 염색완충용액(sodium azaid buffer) 400μl에 섞어 FACScan(Becton Dickinson, San Jose, CA. USA)을 이용하여, 죽은 세포와 세포 부스러기를 제외한 105개의 단일 세포군을 취하여 종양조직내 CD-4, CD8, 및 CD45 양성 세포의 비율을 분석하였다.

통계학적 분석
  
모든 자료는 평균값과 standard error로 표시하였다. 각 군들간의 비교는 대상에 따라 two-tailed students t-test, reapted measured ANOVA test를 이용하여 통계학적 검증을 하였다.

결     과

종양조직내 DISC 바이러스의 표식 유전자 발현 및 종양조직내 GM-CSF의 생산
  
열처리로 변성시킨 DISC-LacZ를 종양내 직접 투여한 실험동물에서는 표식 유전인 Lac-Z 유전자의 발현을 관찰할 수 없었다. 또한 열처리로 변성시킨 DISC-GMCSF를 종양내 직접 투여한 실험 동물에서는 90 pg 미만의 미미한 양의 GM-CSF만이 생산되었다. 반면 변성되지 않은 DISC-LacZ를 종양내 직접 투여한 실험동물에서는 표식 유전인 Lac-Z 유전자의 발현이 효과적으로 일어남을 관찰할 수 있었고, GM-CSF 유전자의 발현 정도를 정량화 하기 위하여 종양조직내 GM-CSF의 양을 ELISA 방법을 통해 측정한 결과 DISC-GMCSF(1×107 pfu)를 종양내 투여한 실험군에서는 투여후 24시간에 종양조직 0.5 g당 4500 pg의 충분한 양의 GM-CSF가 생성됨을 관찰할 수 있었다. 하지만 시간이 지남에 따라 종양조직에서의 GM-CSF 생산은 감소되어, 72시간 뒤에는 DISC-GMCSF 바이러스 투여전 수준으로 떨어졌다(Figs. 1 and 2).

DISC-GMCSF를 종양내(in vivo) 직접 투여시 항암 효과
  
종양 백신 실험시 가장 항종양 효과가 뛰어난 DISC-GM-CSF를 대상으로, 기존의 형성된 종양에서 종양내로 DISC-GMCSF를 직접 투여시, 항암 효과를 알아보았다. 종양세포 투여후 14일째(최종 치료후 5일째) 종양 부피의 비교시, 인산완충생리식염수 치료군:열처리한 DISC-GMCSF 치료군:DISC-GMCSF 치료군=1472±536 mm3:1335±595 mm3:359±332 mm3의 결과를 보였다. 최종치료 후 각 군의 종양부피를 reapted measured ANOVA test를 이용하여 비교한 결과 DISC-GMCSF를 종양내 투여한 군에서 대조군인 생리식염수를 투여한 군이나, 열처리하여 비활성화 시킨 DISC-GMCSF를 투여한 군보다 의미 있는 종양 성장 억제 효과가 있었다(p<0.01)(Fig. 3).

종양조직내 CD4, CD8, 및 CD45 양성 세포의 침윤
  
종양조직내 CD8 양성 세포의 비율은 DISC-GMCSF투여군에서 5.56±1.66%로 생리식염수 또는 열처리한 DISC-GMCSF를 투여한 군(각각 1.33±0.87%, 2.33±1.09%)에 비하여 의미있게 증가되었다(p<0.05). 또한 CD4 양성 임파구의 비율도 DISC-GMCSF투여군에서 20.57±1.97%로 생리식염수를 투여한 대조군(9.96±5.87%)에 비해 의미 있는 증가를 보였다(p<0.05) CD45 양성 세포의 비율도 DISC-GMCSF투여군에서 생리식염수 또는 열처리한 DISC-GMCSF를 투여한 군에 비해 증가하였으나 통계학적 의미는 없었다(Figs. 4 and 5).

고     찰

   유전자 치료에는 여러 전략이 있으며 지금까지 보고된 유전자 치료전략은 크게 5가지로 구분된다. 이중 유전자 치료전략의 과반수 이상을 차지하고있는 것은 종양에 대한 면역반응을 강화시키는 전략이다. 유전자 치료가 등장하기 전부터 많은 항종양 면역치료법이 시도되었으나 만족할 만한 결과를 보이지 못하였다. 종양의 항원으로는 종양세포 추출물, 종양세포내 펩타이드, 열쇼크단백(heat-shock proteins) 등을 항원으로 이용한 보고가 있으나 특이적 종양 항원의 정체는 아직 규명되지 않은 상태이다. 이러한 항종양 면역치료가 성공을 거두지 못한 원인은 종양항원이 존재하지 않아서라기보다는 효과적인 면역반응을 유발하지 못해서라고 생각하며,6) 따라서 항종양 면역반응를 증가시키기 위해 종양에 대한 면역반응을 강화시키는 유전자 치료가 활발히 연구되어지고 있다. 이상적 방법은 추정되는 종양 항원을 함유한 종양세포 자체에서 면역조절물질을 분비하도록 하여, 항종양 면역체계를 자극시키는 방법으로 두경부 종양뿐 아니라 여러 다른 종양에서도 많은 연구가 시도되고 있다.3)4)13) 본 연구에서는 SCC VII 세포를 이용하여 동질 유전자형을 가진 생쥐에 종양조직을 인위적으로 만들었다. 종양 백신 실험 모델을 이용한 종양백신 실험에서 가장 효과적인 면역조절유전자인 GM-CSF 유전자가 이입된 DISC 바이러스를 종양내 직접 주사 후 종양 조직내 GM-CSF의 발현 및 이로 인해 유발되는 항종양 면역 반응으로 인한 종양증식의 억제성을 조사하였다. 또한 종양 조직내 GM-CSF에 의해 유발되는 특이적 항종양 면역반응을 증명하였다.
   위와 같은 유전자 치료의 이론적 근거는 다음과 같다. 첫째, 이입된 유전자에 의하여 사이토카인과 같은 면역조절 물질이 종양세포에서 분비되므로 추정되는 종양 항원과 밀접한 위치에서 효과적인 농도를 유지시킬 수 있으며, 둘째, 지속적 국소적 분비로 인하여, 사이토카인의 전신적 또는 국소적 직접 투여시 문제되는 짧은 반감기 및 부작용을 피할 수 있고, 셋째, 면역조절물질을 면역반응이 일어나는 곳에 공급함으로서 CD4 T임파구의 주작용을 대신할 수 있다.14) 본 실험에 이용된 사이토카인인 GM-CSF는 여러 연구에서 항종양 효과가 입증된 면역조절물질이다.15)16)17) GM-CSF는 항원전달 세포의 성장과 기능을 항진시키며 거식세포나 돌기세포(dendritic cell) 등 항원전달세포의 주요조직적합항원의 표현을 강화시킨다.
  
실험결과 DISC 바이러스는 in vivo 상황에서도 삽입된 유전자를 효율적으로 종양조직에 전달하였으며, 종양조직내에서의 GM-CSF발현도 4,500 pg/0.5 g으로 효율적으로 일어났으며, 이로 인한 항종양효과를 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 DISC 바이러스가 임상적으로 응용될 수 있는 유전자전달매개체(벡터)로서의 가능성을 제시함과 동시에 종양치료에 적용될 수 있다는 가능성을 제시하였다. 최근까지 연구된 유전자 치료에 있어 원하는 유전자를 전달하는 벡터로는 대부분이 바이러스를 이용하였다. 이중 아데노바이러스와 레트로바이러스가 유용한 벡터로 많이 이용되어 왔으나 아데노바이러스는 대부분의 숙주가 이 바이러스에 대하여 면역성을 지니고 있으며 반복적 바이러스의 투여시 면역성으로 인하여 벡터로서의 효율성이 떨어진다는 단점이 있으며, 레트로바이러스는 분열이 일어나는 세포에만 감염이 일어나므로 종양백신과 같이 방사선을 조사해 분열능력이 상실된 세포에서는 부적합한 벡터라고 생각된다. 최근 주목을 받고 있는 헤르페스 바이러스가 두경부편평세포암의 유전자 전달 벡터로서 많은 장점을 가지고 있음이 증명되었다.18) 최근의 연구에 의하면, 헤르페스 바이러스는 거식세포, 섬유아세포, 간세포, 대장암 및 편평상피암세포에서도 유용한 벡터인 것이 증명되었다.18)19)20) 벡터로서 헤르페스 바이러스의 장점은 다음과 같다. 다른 바이러스에 비하여 지놈(genome)의 크기가 크기 때문에(150 Kb), 원하는 유전자를 이입하는데 제한이 적으며, 여러 종류의 세포에 단시간에 효율적인 감염이 가능하며, 무엇보다 가장 큰 장점은 분열하지 않거나 매우 천천히 분열하는 세포에도 효과적으로 원하는 유전 물질을 발현시킬 수 있다는 점이다.7)21) 본 실험에서 사용한 DISC 바이러스는 헤르페스 바이러스의 막을 형성하는 gH 부분의 유전자를 제거하고 여기에 원하는 유전자를 이입시킨 것으로, 숙주세포에 감염후 완전한 복제 과정을 거치나 그 자손들은 유전자 조작으로 인해 감염 능력이 상실된다.22)
   유전자치료를 이용한 항종양 면역치료는 크게 종양 백신을 이용한 ex vivo 치료와 종양 조직내로 원하는 유전자를 운반하는 벡터를 직접 투여하여 종양 조직내에서 원하는 유전자를 발현 시키는 in vivo 치료로 대별된다. 종양 백신은 표적이 되는 종양의 부피가 적을수록 치료의 효과를 기대할 수 있다. 대체적으로 이상적인 종양 표적의 크기는 10 9 개미만의 종양 세포, 크기로는 1.5 cm 미만의 종양이기 때문에 종양 백신은 주 치료법보다는 수술이나 방사선치료후 재발의 원인이 되는 미세잔존암이나 미세전이의 치료전략으로 임상에 이용될 수 있으리라 사료된다. 그러나 진행된 두경부암 중 수술이나 방사선 치료로 근치적 치료가 힘들며 종양의 부피가 클 경우에는 종양 백신보다는 종양조직내에서 직접 원하는 유전자를 발현 시키게하는 in vivo 유전자 치료가 더욱 유용하리라고 생각한다.
   DISC-GMCSF의 종양내 직접 투여한 실험에서 효과적인 GM-CSF의 생산을 확인할 수 있었다. 그러나 DISC 바이러스의 후손들이 다른 숙주세포의 감염 능력이 없으므로 투여후 48시간이 지나, 생체내 농도가 투여전 수준으로 내려가는 것으로 관찰되었다. 이것은 in vitro 실험에서도 같은 양상을 보였으며 따라서 종양조직내 DISC-GMCSF 투여시, 투여 간격을 2일로 하였다. 투여 횟수는 원하는 유전자의 발현기간에 따라 결정되나 어느 정도 기간이 적당한지는 더 많은 연구가 필요하리라 사료된다. 본 실험에서 치료 횟수를 3회 시행한 것은 예비 실험상 가장 효율적으로 좋은 치료성적을 보였기 때문이다. 유전자의 발현 기간이 짧다는 단점이 있으나 DISC 바이러스는 다른 헤르페스 바이러스 백터보다도 세포 독성이 적고 안전하며, GM-CSF 생성의 짧은 반감기는 본 실험에서와 같이 1~2일 정도 간격의 반복 투여로 보상할 수 있으리라 생각한다.12)
   기존의 형성된 종양 조직에 DISC-GMCSF를 종양내로 직접 투여한 결과 의미 있는 종양 성장 억제 효과를 관찰할 수 있었다(p<0.001). 그러나 장기간 추적 관찰 시에는 종양의 성장 속도가 너무 빨라 DISC-GMCSF 바이러스에 의한 항 종양 효과를 희석 시켰다. 따라서 이러한 치료 전략은 큰 종괴의 종양보다는 미세전이나 잔존 암과 같이 종양의 크기가 적은 경우에 효과적이라 생각한다. GM-CSF는 항원 전달 기능을 강화시켜 T-임파구를 통한 세포 독성을 증가시킨다. 따라서 CD4, CD8 임파구는 항 종양 면역과정에 있어 매우 중요한 역할을 담당한다. DISC-GMCSF를 직접 주입한 종양조직에서 세포를 분리하여 종양 조직에 침투된 임파구를 flow cytometry를 통하여 분석한 결과, CD8 및 CD4 양성 T-임파구가 대조군에 비해 의미 있게 증가했음을 관찰할 수 있었으며, 아울러 전반적인 T 임파구와 B 임파구의 표면 항원인 CD45 양성세포도 증가된 양상을 보였다. 이것은 DISC-GMCSF 바이러스가 종양세포에 감염후 유전자 이입을 통한 GM-CSF의 생산을 유발하여 항 종양 면역 세포의 증가를 가져온 것으로 생각한다.

결     론

   DISC-GMCSF를 종양내 직접 투여한 실험에서 안전하고, 효과적인 GM-CSF의 생산을 확인할 수 있었으나, 벡터인 바이러스는 1회 분열에 그치므로 투여후 48시간이 지나며, 생체내 농도가 투여전 수준으로 내려가는 것으로 관찰되었다.
   종양내 DISC-GMCSF의 반복 투여는 의미 있는 종양 성장 억제효과를 보였으며 종양 조직내 항종양 면역에 관여하는 세포독성 T-임파구의 증가를 가져왔다. 이상의 결과로 미루어, DISC-GMCSF의 종양내 직접 투여는 효과적인 유전자의 발현 및 이로 인한 종양 성장의 억제를 가져왔으며, 이러한 유전자 치료가 두경부편평세포암종의 새로운 치료방법으로 응용될 수 있으리라 생각된다.


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