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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 43(12); 2000 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2000;43(12): 1305-1311.
Expression of Nitiric Oxide Synthase lsoenzymes in Normal Nasal and Polyp Mucosa of Human.
Dae Gun Jung, Byung Guk Kim, So Young Park, Seung Won Kim, Sa Yong Chae, Hee Ro Yoon
Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, St. Paul's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea. dgjung@sph.cuk.ac.kr
사람의 정상 비점막과 비용에서 산화질소 합성 동위효소(Nitric Oxide Synthase Isoenzyme)의 발현
정대건 · 김병국 · 박소영 · 김승원 · 채세용 · 윤희로
가톨릭대학고 의과대학 성바오로병원 이비인후과학교실
주제어: 산화질소 합성효소역전사-중합효소 연쇄반응면역조직화학염색.
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Nitric oxide (NO) seems to have some potential to play a regulatory role in the airway function and it maybe related to the pathophysiology of several airway diseases. Although the pathophysiology of nasal polyp is poorly understood, a recent study has suggested that airway NO produced from paranasal sinus epithelium where mNOS is expressed constituitively without immunologic stimulation may play a critical role in the genesis of inflammatory nasal disease.
MATERIALS AND METHODS:
We examined the presence of mNOS and eNOS in the nasal cavity and paranasal sinus mucosa in 10 healthy persons of nasal septal deviation and 20 patients with nasal polyp by immunohistochemical staining using rabbit polyclonal anti- eNOS and anti-mNOS IgG. Relative quantification of eNOS and mNOS was done by RT-PCR.
RESULTS:
Immunoreactivity to eNOS and mNOS was positive in all nasal polyps and this reactivity was mainly restricted to the epithelial layer. Immunoreactivity to mNOS in the controls was negative for the inferior turbinate. RT-PCR showed more mNOS reactivity in the nasal polyp than in the control (p<0.03).
CONCLUSION:
These findings reinforce the concept that the epithelial layer is the main locus and mNOS may be one of the potential factors in the pathogenesis of nasal polyp.
Keywords: Nitric oxide synthaseImmunohistochemistryRT-PCR

서     론


   산화질소는 신경 전달, 혈관 확장 및 숙주 세포 방어를 포함한 다양한 생리 과정을 중재하는 신호 전달 물질로서 산화질소 합성효소에 의해 L-arginine이 L-citrulline으로 대사하는 과정에서 생성되는 가스 형태의 무기 유리기(inorganic free radical)이다. 과거에는 단순한 독성 물질로만 알려져 있었으나, 1987년 산화질소가 사람의 여러 세포에서 생산됨이 발견되었고,1) 기존에 endothelial derived relaxation factor(EDRF)로 알려진 물질과 산화질소가 동일한 물질로 밝혀지면서 산화질소의 생리 작용에 대한 연구가 시작되었다.2) 산화질소는 반응성이 매우 강하고 반감기가 6~10초 정도로 매우 짧기 때문에 특정 기관에 작용하려면 그 부위에서 국소적으로 생산되어야 할 것으로 생각되며 반감기가 짧은 기체 상태이므로 직접적인 연구가 어려워, 생체 내에서 L-arginine으로부터 산화질소를 생산해 내는 산화질소 합성효소에 대한 연구나 산화질소의 대사 산물인 질산염, 아질산염을 연구하는 등 간접적인 방법이 주로 이용되어 왔다.
   비강 및 부비동에서 생산되는 산화질소의 역할과 특성을 알기 위해서는 비강 및 부비동 점막 상피의 산화질소 합성 동위효소의 발현이 질환에서 어떻게 변화하는지 관찰하는 것이 필요하다. 정상 비강의 하비갑개 점막을 면역조직화학적으로 염색한 결과 eNOS, mNOS 모두 양성 반응을 보이나 그 반응은 상피층에 국한되지 않았다는 보고와,3) eNOS는 양성 반응을 보이나 mNOS는 음성 반응을 보이고 주로 상피층에서 양성 반응을 보이고 있다는 상반되는 보고가 있다.4)5) 산화질소는 기관지 천식,6)7) 만성 부비동염 및 비염,8) 비용4)5) 등 질환의 병태 생리와도 연관이 있다는 보고들이 있으나 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 특히 만성 부비동염 및 비염에서 호기 내의 산화질소 농도가 감소한다는 보고는 그 이유가 부비동 개구부가 염증에 의해 폐쇄되어 부비동 내에서 생성된 산화질소가 배출되지 못해서인지 부비동 점막의 산화질소 생산 능력이 감소해서인지 더 연구해야 할 것으로 생각된다.8) 이에 저자는 정상 및 비내 질환으로 흔히 볼 수 있는 비용 환자를 대상으로 mNOS와 eNOS에 대한 면역조직화학적 염색과 역전사-중합효소 연쇄반응을 통하여 비강 및 부비동 점막 상피의 산화질소 합성 동위효소 발현 양상의 변화를 알아보고자 한다.

재료 및 방법


대상 및 재료

   대조군은 알레르기, 천식 및 비질환의 과거력이 없는 10명의 비중격만곡증 환자의 하비갑개 점막과 상악동 및 사골동 점막을 대상으로 하였다. 하비갑개나 상악동, 사골동의 조직을 아무런 질환이 없는 정상인에서 얻기는 어려움이 많아, 비중격 만곡증에 의한 하비갑개의 변화를 생각해 볼 수 있으나 실험군인 비용과는 그 비교가 가능 할 것으로 사료되어 대조군으로 하였다. 실험군은 전비경검사에서 비용이 확인되거나 전산화단층촬영에서 부비동 비용이 있는 20명을 대상으로 하비갑개의 용종양의 변화를 보이는 점막과 상악동 및 사골동에 발생한 비용의 점막을 채취하였다.
   윤리적인 측면으로 대조군과 실험군의 환자에게 실험의 배경을 설명하여 동의된 환자를 대상으로 하였고, 병원의 윤리위원회에도 허락을 받아 시행하였다.

방  법


조직 준비
   대조군은 10명의 환자에서 비중격성형술을 시행한 후 10개체의 하비갑개 조직을 채취하였고, 구상돌기를 제거한 후 10개체의 전사골동 조직을 얻었고, 상악동의 자연개구부가 열려있는 경우에만 30, 70도 내시경을 보면서 5개체의 상악동 조직을 얻을 수 있었다.
   실험군은 대상자 20명에서 부비동내시경수술을 시행하여 사골동의 비용은 20개체를 얻을 수 있었으나, 하비갑개의 용종성 점막은 5개체, 상악동의 비용은 5개체만 얻을 수 있었다.
   수술 중 채취한 조직은 반으로 나누어 반은 면역조직화학적 염색을 위해 10% paraformaldehyde에 고정후 파라핀에 포매하였다. 포매된 점막을 6 μm 두께의 연속절편으로 만든 다음 Probe On slide(Fisher Scientific, PA, U.S.A.)에 부착시켰다. 나머지 절반은 역전사-중합효소 연쇄반응을 위해 떼어낸 즉시 RNA의 파괴를 막기 위해 RNA later에 넣은 다음 바로 -70°C 냉장고에 보관하였다.

면역조직화학염색
   면역조직화학염색을 위한 일차 항체로 rabbit polyclonal anti-mNOS IgG와 anti-eNOS IgG(Transduction Laboratories, Lexington, KY, U.S.A.), 일차 항체의 항원-항체 결합을 검출하기 위해 Vectastain Elite ABC Kit(Vector Laboratories, Burlingame, CA, U.S.A.)를 사용하였다.
   슬라이드에 부착된 조직을 자일렌과 histoclear가 2:1로 혼합된 용액으로 탈파라핀한 후 100% 알코올로 탈수시킨 후 증류수로 세척하였다. 37°C에서 1% pepsin으로 10분간 처리한 후 Tris-HCl 완충액으로 세척하고 내인성 peroxidase 활성을 억제하기 위해 37°C에서 3% H2O2로 10분간 처리하고 나서 Tris-HCl 완충액으로 세척하였다. 조직 내의 비특이적인 면역반응을 억제하기 위해 37°C에서 PBS로 희석된 정상 마혈청으로 30분간 항온 반응시킨 후 1:50으로 희석된 일차 항체를 4°C에서 하룻밤 동안 반응시켰다. Tris-HCl 완충액으로 세척하고 이차 항체(biotinylated anti-rabbit IgG)를 37°C에서 30분간 반응시킨 다음 완충액으로 세척하고 horseradish peroxidase-labelled avidin과 37°C에서 15분간 반응시켰다. 0.1M 초산염 완충액에 발색제로 사용한 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)와 3% H2O2 용액을 잘 혼합한 다음 37°C에서 10분간 반응시키고 증류수로 세척한 다음 hematoxylin으로 1분간 대조 염색하였다. 증류수 세척 후 200배의 광학현미경으로 관찰하였다. 음성 대조 염색은 하비갑개 점막을 이용하여 일차 항체 대신 희석액만을 첨가하여 위와 동일한 방법으로 염색하였다.

역전사-중합효소 연쇄반응

   역전사-중합효소 연쇄반응을 위해 Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase(M-MuLV,Roche, Mannheim, Germany), Taq DNA polymerase, deoxynucleotide triphosphatase(dNTPs), RNase inhibitor(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)를 사용하였고 RNA 추출은 RNAwiz, RNAlater(Ambion, Texas, U. S. A.)를 사용하였다.

전체 RNA의 분리
   RNA의 분리는 Ambion사의 RNAwiz를 사용하여 분리하였다. 점막 100 mg당 1 ml의 RNAwiz를 넣고 Homogenizer(Tekmar, Texas, U.S.A.)를 이용하여 점막을 분쇄하여 균질화시켰다. 이 분쇄액에 isoamyl alcohol이 포함되지 않은 chloroform을 RNAwiz 1 ml당 200 μl씩 넣고 원심 침전하여 상층액을 채취하고 DEPC-증류수 500 μl와 1 ml의 isopropanol을 넣은 후 원심 침전하여 pellet을 얻었다. 상층액을 조심스럽게 제거한 후 건조하여 RNA를 얻었다. spectronic 21D(Milton Roy, Rochester, NY, U. S. A.)를 이용하여 260 nm, 280 nm에서 순도 및 정량을 하고 이 중에서 순도가 1.7이상의 RNA만을 이용하여 cDNA 합성 때까지 -70°C에서 보관하였다.

cDNA 합성

   분리한 mRNA 1 μg에 random headers primer(Beringer Mannheim) 2 μl를 혼합하고 DEPC-증류수를 넣어 11.2 μl가 되게 하여 60°C에서 5 분간 반응시키고 급속히 얼음 속에서 냉각시킨 후 5 x reaction buffer(Boehringer Mannheim) 4 μl, 20 U RNasin(Boehringer Mannheim) 0.5 μl, dNTP(각각 7.5 mM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 혼합체) 3 μl, 400 mM의 DTT(1, 4-dithiothreitol) 0.5 μl, 20 U의 M-MuLV reverse transcriptase(Boehringer Mannheim) 0.8 μl를 첨가하여 총량을 20 μl로 만든 후 37°C에서 1시간, 70°C에서 10분간 반응시키어 cDNA를 합성하였다.

중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)

   중합효소 연쇄반응은 cDNA 2.5 μl, 5' 시발체와 3' 시발체 각각 2.5 μl, dNTP(각각 7.5 mM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 혼합체) 1.4 μl, 10 x reaction buffer 5 μl, 증류수 35 μl 및 Taq DNA polymerase(Boehringer Mannheim) 2.5 U를 혼합한 후 Gene cycler(Biorad, Hercules, CA, U.S.A.)를 사용하여 증폭하였다. 반응 조건은 β-actin은 95°C 1 분간 초기 변성 후 94°C 30초, 55°C 30초, 72°C 1 분간의 주기로 30회 실시하고 72°C 5분간 1회 시행하였다. eNOS, mNOS는 94°C 2분간 초기 변성 후 94°C 30초, 55°C 1분, 68°C 1분간의 주기로 35회 실시하였고 그 다음 68°C 7분간 1회 시행하였다.
   중합효소 연쇄반응 후에 반응액을 ethidium bromide가 포함된 1.5% 한천 겔에서 전기영동 하였다. marker는 DNA molecular weight marker(Roche, Mannheim, Germany)를 사용하였고, 자외선 투사기(ultraviolet transilluminator) 상에서 증폭 유무를 확인하고 영상분석기와 densitometer(BIO-1D/BIO-GENE, Vibert Lourmat, Torcy, France)를 이용하여 발현양상을 계측하였다.

통계분석

   대조군 및 실험군 30개체의 eNOS mRNA/β-actin mRNA, mNOS mRNA/β-actin mRNA의 비율(%)을 Wilcoxon의 순위합 검정법으로 비교하였고 유의 수준을 p<0.05로 하였다.

결     과


면역조직화학적 염색 소견

   대조군의 경우 mNOS는 하비갑개에서는 음성반응을 보였고, eNOS는 주로 점막의 상피층의 전부위에서 양성 반응을 보였다. 상악동 및 사골동의 점막에서 eNOS, mNOS는 상피층의 전부위에 양성 반응을 보였다.
   실험군의 경우 하비갑개의 용종양의 변화를 보이는 점막과 상악동 및 사골동의 비용 점막 모두에서 eNOS와 mNOS에 대해 양성 반응을 보였으며 역시 상피층의 전부위에서 반응을 보였다(Fig. 1).

역전사-중합효소 연쇄반응 소견
   eNOS mRNA는 대조군의 경우 하비갑개와 상악동 및 사골동의 점막 모두에서 발현되었고, 실험군에서도 하비갑개와 상악동 및 사골동의 점막 모두에서 발현되었다.
mNOS mRNA는 대조군의 경우 하비갑개(Lane 1)를 제외한 상악동과 사골동의 점막(Lane 2, 3)에서 발현되었고 실험군의 경우 하비갑개의 용종양 변화를 보인 점막과 상악동 및 사골동(Lane 4, 5, 6)에 발생한 비용의 점막 모두에서 발현되었다. 대조군에 비해 실험군에서 mNOS mRNA의 발현이 통계학적으로 유의하게 증가되었다(p<0.03). 그러나 비용 발생 부위에 따른 mNOS mRNA의 발현의 정도는 통계학적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(Table 2 and Fig. 2).

고     찰


   산화질소 합성효소는 간, 뇌, 심장, 정맥, 폐, 비장, 부신 등 여러 기관의 대식세포, 내피세포, 혈소판, 혈관간세포, 섬유아세포, 호중구, 간세포, 비만세포, 상피세포, 신경세포 등에서 발견되었다.9) 발견되는 세포와 특성에 따라 일반적으로 nNOS(neuronal NOS, type I NOS), mNOS(macrophage NOS, type II NOS), eNOS(endothelial NOS, type III NOS)의 3가지 동위효소로 구분하고 있다. 이들 중 nNOS와 eNOS는 세포내의 칼슘 농도가 충분하여야 활성도를 유지하고 소량의 산화질소를 생산하면서 스테로이드에 의해 발현이 억제되지 않고 항상 존재하고 있어 구성형(constitutive form) 이라고 한다. 반면에 mNOS는 면역학적인 자극 즉 리포다당질이나 사이토카인의 자극이 있을 때만 발현되며 스테로이드에 의해 발현이 억제되고 세포 내에 칼슘의 농도와는 상관없이 일단 발현되면 활성도가 매우 높아 다량의 산화질소를 생산할 수 있어 유도형(inducible form)으로 분류하고 있다. 그러나 최근에는 외상이나 어떤 병적 조건에 의해서도 nNOS와 eNOS가 유도되는 것으로 알려지고 있다.10) 현재까지 알려진 산화질소의 생리 작용은 신경 전달, 혈관 이완, 항균 및 항암 등의 세포 독성 매개 작용 등이 대표적이며 이외에도 혈소판 응집과 흡착을 억제하고 면역 조절 및 국소, 전신 염증 반응 등의 다양한 생리적 기능이 있을 것으로 추정되고 있다.11)
   비강 및 부비동을 포함한 호흡기계에서의 산화질소의 생성과 역할에 대한 연구는 사람의 호기 가스에 포함된 산화질소의 농도가 대기 중의 산화질소보다 높다는 사실이 발견되면서 시작되었다.12) 호기 가스 내의 산화질소는 주로 부비동에서 생산되며 특히 상악동이 그 대부분을 차지한다고 한다. 부비동 점막에 발현되어 있는 산화질소 동위효소는 분자구조나 활성도 면에서는 mNOS이면서도 구성형의 특성을 띄며, 스테로이드 투여 후에도 발현이 억제되지 않는다는 면에서 사람의 다른 기관에 발현되어 있는 산화질소 동위효소와는 다른 특성이 있다.13)14) 부비동 점막에 다량의 산화질소를 생산할 수 있는 산화질소 동위효소는 부비동의 무균 상태 유지와 비강을 포함한 호흡기계의 항상성 유지에 필요한 산화질소를 생산하기 위해 필요한 것으로 보고되었다.3) 부비동에서 산화질소의 생리적인 역할로는 항균15) 및 항바이러스 작용,16) 섬모의 점액수송 조절,17) 폐혈류량의 조절,18) 기관지 평활근 수축의 조절19) 등 정상기능과 관련이 있을 것이라는 보고가 있다. 그러나 산화질소 동위효소의 존재를 확인하고자 할 때는 면역조직화학적 염색뿐 아니라 역전사-중합효소 연쇄반응 등의 반정량적 혹은 Nothern blot 등의 정량적 분석이 동반되어야 한다. 본연구에서 대조군의 하비갑개 점막에서는 Ramis나 Watkins의 보고와 일치하게 eNOS는 상피층에서 양성 반응을 보이나 mNOS는 음성 반응을 보였다. 상악동과 사골동 점막에서는 eNOS, mNOS가 모두 양성 반응을 보이고 반정량적 분석 결과 eNOS가 mNOS 보다 더 발현이 되었다.
   비용의 여러 병인론 중에서 상기도의 바이러스감염 후에 흔히 세균의 이차감염으로 화농성 부비동염이 생기고 염증성 변화로 점막이 비용으로 된다는 병인론이 주목을 받고 있으며 최근에는 비용과 산화질소와의 연관성에 대한 보고가 있다.4)5) 이들의 보고에 의하면 비용에서 역전사-중합효소 연쇄반응 결과 mNOS의 발현이 증가되고 면역조직화학적 염색 결과 점막의 상피층에 양성 반응을 보인다고 했다.
본 연구에서도 실험군인 하비갑개의 용종양의 변화를 보이는 점막과 상악동 및 사골동에 생긴 비용에서 면역조직화학적 염색 결과 하비갑개의 용종양의 변화를 보이는 점막은 대조군과는 달리 mNOS가 양성 반응을 보이고 실험군 모두 eNOS, mNOS에 대해 양성 반응을 보이고 주로 상피층에 고르게 양성 반응이 나타났다. 역전사-중합효소 연쇄반응에서도 eNOS mRNA, mNOS mRNA가 모두 발현되었고 대조군에 비해 mNOS mRNA의 발현은 densitometer로 측정한 결과 통계학적으로 의의 있게 증가되었다. 이로 보아 하비갑개와 상악동 및 사골동 점막의 상피층에 존재하는 mNOS가 초기염증에 의해 발현이 증가되어 다량의 산화질소를 만들고 증가된 산화질소에 의해 염증이 지속, 반복되면서 정상 점막이 비용이나 용종양의 점막으로 변화한다고 생각한다.

결     론


   본 연구에서 저자는 산화질소가 비용 및 용종양의 점막에서 증가함을 확인 할 수 있었다. 그러나 비용의 생성원인이 산화질소에 의해 전적으로 좌우된다고 할 수는 없으므로 향후 산화질소 합성효소의 억제제를 투여하고 비강 및 부비동의 산화질소 농도를 조절하여 비용의 변화를 보는 것이 필요하다고 생각한다.


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