서     론

   세포고사(apoptosis)는 세포 사멸의 한 형태로 계획되어진 세포 사멸(programmed cell death)이라 할 수 있고 세포질의 농축, DNA의 분절을 특징으로 하며 정상발달, 기관 형성, 면역기능, 조직의 성장 등에서 세포를 제거하는 기능을 한다. 이처럼 정상 세포의 일정한 밀도 유지에 중요한 세포고사에 장애가 생기면 종양이 발생될 수 있어 세포고사는 현재 많은 종양모델에서 발암과정의 중요한 기전으로 제시되고 있다.¹⁾ 세포고사는 아주 다양한 조절인자에 의해서 영향을 받으며 진화적으로 유지되어온 세포자살기전을 통해서 이루어진다. 세포에서 세포고사가 유도될 때에는 bcl-2, bax, p53, APO-1/Fas, Fas ligand 등과 같은 여러 유전자들(protooncogene) 사이의 정교하게 균형이 잡힌 상호작용에 의해 조절된다. 이중 bcl-2 유전자는 anti-apoptotic ced-9 유전자의 포유류 상동물(mammalian homolog)로서 B세포 여포상 림프종에서 처음 기술되었고 세포고사를 억제함으로서 지속적인 세포증식을 일으키는 것으로 알려져 있다.²⁾ bcl-2의 과량발현은 최근 폐암, 갑상선암, 유방암, 위암, 난소종양 등^3-5)에서 보고되고 있다. Fas ligand(이하 Fas-L)는 정상적인 면역계의 발달, 항상성 유지, 조절 및 기능에 중추적 역할을 담당하며, 이는 감작된 세포의 표면에 있는 수용체인 Fas(CD95)와 결합하여 그 세포의 고사를 유도한다.⁶⁾ 따라서 Fas 매개성 고사 유도는 면역학적으로 중요하며 이의 기능장애는 여러 가지 자가면역성 질환 뿐만 아니라, 각종 림프성 및 비림프성 악성종양에서의 Fas 매개성 세포독성의 내성이 밝혀지면서 이에 의하여 종양세포가 숙주의 면역감시 체계를 피할 수 있으며, 이는 곧 종양형성에 관여할 수 있음을 알게 되었다.⁷⁾ 즉 Fas/Fas-L의 상호작용은 악성 림프종 및 자가면역성질환 뿐만 아니라 식도암 및 대장암과 같은 상피기원의 악성종양에서 종양세포가 숙주의 끊임없는 면역감시를 피하는 과정에 관여한다. 즉 종양의 형성 및 진행과정에 숙주의 면역기능이 억제자로서 작용한다는 기존의 잘 알려진 이론에 추가로, 종양세포에 의한 적극적인 면역구 파괴능력이 종양의 형성 및 진행과정에 촉진제로 관여한다는 것이다(Fas counterattack theory).^8-11) 비-부비동종양 중 반전성 유두종은 드물게 발생하는 양성 상피 종양이지만 임상적으로 국소 침윤, 높은 재발율, 악성종양과 동반 및 악성전환 등의 특징이 있어 전암성 병변으로 간주되고 있어 그 성장과 악성변화로의 기전에 관한 연구를 통해 암의 다단계 암화과정을 이해하기 위한 방법으로 많이 이용되고 있다. 그러나 비-부비동 악성종양의 세포고사에 관여하는 bcl2와 Fas-L의 발현유무 및 정도와 종양의 진행 및 예후 관련 인자들과의 관련성 여부에 대하여는 잘 알려지지 않았다. 이에 저자들은 이들 인자들의 면역조직화학적 염색을 통하여 상호 연관성을 검토하고, 임상적 특징과 비교하여 비-부비동 종양에서의 이들 인자들의 역할에 관하여 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   1992년부터 1998년까지 7년간 조선대학교 의과대학 이비인후과학교실에서 조직검사로 진단된 비강 및 부비동 종양 중 조직의 재검토가 가능하고 파라핀 블록이 충분한 반전성 유두종 22례, 반전성 유두종이 암과 동반되었거나 추후 편평세포암으로 변한 4례와, 편평세포암 14례를 대상으로 하였으며 대조군으로는 5명의 정상 성인의 하비갑개 점막을 사용하였다. 연령분포는 23~70세로 평균 연령은 48.2세였고 성별은 남자 30례, 여자 16례였다.

임상적 소견의 검토

   환자의 임상기록과 병리기록으로부터 편평세포암군에서는 임상적 병기, 나이, 성별, 예후 그리고 반전성 유두종군에서는 술후 재발빈도, 악성도 등 여러 임상적 특징을 후향적으로 분석하였다.

염색방법

세포고사를 확인하기 위한 염색
   Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)가 달린 DNA의 3’-OH 끝에 특이하게 deoxynucleotide를 결합시키는 것을 이용하였다. 파라핀에 포매된 조직절편을 proteinase K(20 μm/ml)로 37°C에서 25분간 처리한 후 증류수로 세척하였다. 그 후 Apotag Plus Peroxidas In Situ Apoptosis Detection Kit(S-7101, Intergen, San Diego, CA)를 사용하여 염색하였다. 즉 TdT 효소와 반응시켜 gigoxigenin이 표지된 뉴클레오타이드를 결합시킨 후 효소반응을 중단시키고 anti-digoxigenin peroxidase를 반응시키고 3,3’-diaminobenzidine(Sigma. St. Louis, Mo)으로 발색시켰다. 염색의 판정은 괴사지역을 피해서 염색이 잘된 부위 10군데를 선정하여 고배율에서 핵에 뚜렸한 염색이 된 종양세포를 세어 평균 백분율을 구했다(세포고사지수；Apoptosis Index, AI). 양성 대조군으로는 키트에 포함된 사람의 갑상선 조직을 이용하였다. 세포고사지수는 염색된 슬라이드를 광학 현미경(Olympus BX-50, Japan)을 통해 검경하여 괴사지역을 피해 염색이 잘 된 10군데 정도의 부위를 선정하여 대물렌즈를 ×20에 맞춘 후 SVMicro Digital Camera for Microscope(Sound Vision, Taunton, MA)을 통한 digital image를 cable로 연결된 컴퓨터로 전송하여 Visus Image Analysis System(Image & Microscope Technology, Foresthill, CA)을 이용하여 분석하였다.

Bcl-2 염색
   일반 광학현미경 검경 후 선택된 파라핀괴를 각각 4 μm로 박절하여 탈파라핀과 함수과정을 거친 후 bcl-2(N 1587, clone-124, DAKO, Carpenteria, CA)에 대한 면역조직화학적 염색을 LSAB plus kit(K 0679, DACO)와 AEC kit(K 0697, DACO)을 이용하여 ABC법으로 시행하였다. bcl-2는 ready-touse form이었으며, 항원성을 살리기 위해 Fas-L염색과 동일한 마이크로 웨이브 오븐을 이용한 일련의 과정을 거쳤다. 양성 대조군으로는 반응성 여포증식(reactive follicular hyperplasia)이 초래된 림프절을 이용하였으며, 염색 결과의 판정은 종양세포의 핵이나 세포질에 갈색으로 염색되는 세포가 전체 종양세포의 10% 이상일 때를 양성으로 분류하였는데 염색되는 세포가 종양세포의 10% 미만일 때를 ±, 10~24% 양성인 경우 약양성(＋, weakly reactive), 25~49% 양성인 경우 중등도 양성(＋＋, moderately reactive), 50% 이상의 세포에서 양성인 경우를 강양성(＋＋＋, strong reactive)으로 분류하였다. 임상적 변수와 비교시 10% 이상을 양성으로 10% 미만의 발현은 음성으로 하였다.

Fas-L 염색
   통상의 방법(ABC method)에 따라 4 μm 두께의 조직을 탈파라핀 한 후 10 mM 구연산 완충용액(pH 6.0)에 담근 채 900 watt의 마이크로웨이브 오븐에 5분씩 3회 처리하고, avidin-biotin-immunoperoxidase complex를 이용하여 염색하였다. 일차 항체는 Fas-L(N-20-G, Santa-Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA)를 1：50으로 희석하여 120분간 37°C에서 반응시키고 TBS(Tris buffered solution) 완충액으로 세척한 후 Immuno Cruz staining system(SC-2053, Santa-Cruz Biotechnology Inc, Santa-Cruz, CA)를 이용하여 일련의 과정을 거친 후 Meyer’s hematoxylin으로 대조 염색하였다. Fas-L에 대한 염색은 뚜렸한 세포질내의 염색을 모두 양성으로 판정하였다. 염색되는 세포가 전체 종양세포의 10% 미만인 경우를±, 전체종양세포의 10% 이상일 때를 양성으로 분류하였는데, 10~24%양성인 경우 약양성(＋), 25~49% 양성인 경우 중증도 양성(＋＋), 50% 이상의 세포에서 양성인 경우를 강양성(＋＋＋)으로 분류하였다. 부피질 림프양 증식(paracortical lymphoid hyperplasia)이 초래된 림프절을 양성 대조군으로 하였다. 임상적 변수와 비교시 10% 이상을 양성으로 10% 미만의 발현은 음성으로 하였다.

통계학적 검증
   Bcl-2 및 Fas-L에 대한 염색반응의 정도가 각 실험군 간에 어떠한 유의한 차이를 보이고 있는가를 파악하기 위해 chi squre test, student’s t-test 및 ANOVA를 시행하였으며 통계적 신뢰한계(p값)는 0.05이하로 판정하였다.

결     과

세포고사의 발현

   편평세포암의 세포고사지수는 1.5에서 7.8%까지 분포하였고 평균은 3.66±1.80%였으며, 반전성유두종과 편평상피암과 연관성이 있는 군에서는 평균 5.22±4.92%였으며, 반전성유두종에서는 1.24에서 29.4%까지 다양하였고 평균 8.30±5.80%로 반전성 유두종군에서 가장 높았고, 반전성 유두종에서 편평세포암군으로 갈수록 세포고사지수가 낮아지는 경향을 보였으며 통계적으로 의의가 있었다(p<0.05). 대조군으로 사용한 정상 비점막에서는 0.24±0.11%로 극히 미미하게 발현되었다(Table 1).

Bcl-2의 양성발현율

   편평세포암조직에서 14례중 4례 28.6%, 반전성유두종과 편평세포암 연관성군에서는 4례중 1례 25.0%, 반전성유두종군에서는 22례중 2례로 9.1%의 양성발현율을 보였다(p>0.05). 정상 비점막에서는 음성반응을 나타냈다(Table 1).

Fas-L의 양성 발현율

   편평세포암에서 14례중 10례로 71.4%, 반전성유두종과 편평세포암 관련군 에서는 4례중 1례 25.0%, 반전성유두종군에서는 22례중 6례 27.3%의 양성발현율을 보여 편평세포암에서 더 높은 양성 발현율을 보였다(p<0.05). 정상 비점막경우 상피내에서는 음성반응을 보였으나 내강연(luminal free border)에서는 ＋＋정도의 중등도 양성반응을 보였다(Table 1).

Bcl-2, Fas-L양성 발현율과 세포고사지수와의 상관분석

   편평세포암군, 반전성유두종군, 정상대조군 간에 bcl-2 경우는 통계적으로 유의하지 않았으나(p>0.05), Fas-L 경우 편평세포암군에서 높은 양성 발현율을 보인 반면 낮은 세포고사지수를 보여, 종양의 악성화(malignant trans-formation)와 세포고사지수의 감소가 유의한 상관관계가 있었다(p<0.05).

임상적 특징과 발현율과 비교분석(Table 2, 3)

   편평세포암군에서 임상적 병기, 예후, 성별 그리고 반전성유두종에서 술후 재발빈도, 악성도 등 여러 임상적 특징과 비교분석시 통계적으로 유의성은 없었다(p>0.05).

고     찰

   세포는 괴사(necrosis)와 고사과정에 의하여 소실되며, 정상조직의 경우는 세포의 증식과 소실간의 수적 평형이 유지된다. 세포의 증식력이 증가하거나 사멸이 감소하게 되면 세포의 수적 증가가 이어져 종양을 형성할 수 있다.¹²⁾ 종양의 발암과정에는 세포의 증식과 성장을 촉진하는 유전자와 억제하는 종양 억제 유전자 그리고 고사를 조절하는 유전자 등이 복잡하게 관련되어 있으며 단계별로 다양하게 작용한다.¹²⁾¹³⁾ 이러한 세포고사 기전에 장애를 일으키는 경우 종양이 발생할 수 있으며 이는 종양의 악성화 및 종양의 생물학적 특성 그리고 종양치료에 대한 반응성 등에 중요한 역할을 한다고 한다.¹²⁾
   Bcl-2는 세포고사에 관여하는 중요한 인자이며, 여포성 림파종의 경우 bcl-2의 세포고사가 억제되고, 이에 따라 세포증식이 일어나 종양이 발생한다. bcl-2의 기능은 bcl-2 계열인 다른 단백질에 의해 조정되는데 즉 bax, bad는 bcl-2의 활동을 억제시켜 세포고사를 촉진시키고 bcl-xl은 bcl-2의 활동을 증가시켜 세포고사를 억제한다.²⁾ 이런 bcl-2 단백물질이 혈액종양 이외에도 폐암, 유방암, 전립선암, 결장직장암 등은 물론 정상적인 여러 조직에서도 발현된다고 한다.^3-5) 두경부암에서 bcl-2발현의 예후에 미치는 영향에 대해서는 많이 연구되었으나 그 결과는 아직도 논란의 여지가 많다.^14-16) Sheu 등¹⁷⁾은 비인두를 대상으로 한 연구에서 bcl-2의 발현은 정상, 이형증, 암 순으로 높았으며 이것은 bcl-2가 세포고사를 억제하여 비인두암의 다단계 발암과정 중 발생 초기에 중요한 역할을 할 것이라고 시사하였다. 그러나 Kikuchi 등¹⁾은 세포고사 지수가 용종, 암, 고등급 선종(high grade adenoma) 순으로 높았으며 bcl-2지수도 용종, 암, 선종 순으로 높게 나타나 세포고사 억제에 bcl-2의 역할은 낮다고 하였으며 다른 종류의 조절인자에 대한 연구 필요성을 언급하였다. 본 연구결과 역시 bcl-2의 비-부비동 종양에서 종양의 악성화에 관여하는 역할은 미약한 것으로 판단되었다. 그 이유로는 첫째, 반전성 유두종에서 발현되는 강도와 편평세포암에서 발현되는 정도에 전혀 차이를 보이지 않으며, 전체적으로도 낮은 비율(전체증례 대비 양성증례), 낮은 양성도(양성 증례의 염색강도 및 양성 염색 세포의 수적 비율)를 보여 bcl-2가 일부 관여는 되지만 주된 역할은 하지 않는 것으로 판단되었으며, 둘째, bcl-2 발현정도와 세포고사지수의 비교 분석시 의미 없게 나와(p>0.05) 비강 및 부비동 악성종양의 종양발생(tumorigenesis)에 bcl-2는 미미한 역할을 담당할 것으로 생각되었다.
   최근 종양 침윤 림파구(tumor infiltrating lymphocytes, TIL；T-cell)에 대한 연구가 활발히 진행 중이다. 각종 암의 발생 소멸과정에 숙주의 면역체계가 중요한 결정인자로 관여하며, 면역구에 의한 종양세포의 고사는 암의 발생 및 소멸 그리고, 진행에 큰 영향을 미친다고 알려져 있으며, 또한 면역구에 의한 종양세포의 고사에 반하는 종양세포에 의한 주변 면역구의 고사현상(역 공격；counterattack)이 시험관내(in vitro) 연구를 통하여 그 결과가 보고되었다.⁸⁾ 즉 Fas-L는 Fas 수용체를 갖는 세포의 세포고사를 유발하게 되므로 종양세포의 Fas-L발현은 결국 종양주변의 Fas 발현 림프구의 고사를 초래하게 된다. 그러나, 역으로 Fas-L발현 림프구는 Fas발현 종양세포의 세포고사를 유도하게 되므로 Fas-L발현 종양세포 자체의 세포고사는 줄어들게 된다.^8-11) 실험에 이용된 검체가 편평세포암의 TIL 경우는 다수 관찰되었으나, 반전성 유두종의 경우는 TIL이 거의 없어서 평가의 제한성으로 분석하지는 않았으나, 다른 연구^8-11)의 경우는 종양세포의 Fas-L발현 여부/정도에 따른 TIL의 세포고사지수를 비교 분석하여 Fas-L발현 종양의 낮은 세포고사지수를 증명하고 있다. 본 연구에서도 반전성 유두종군에 비해 편평 세포암군에서 상대적으로 높은 Fas-L 양성 발현율에 비해 상대적으로 낮은 세포고사지수를 보이는 역 상관관계를 보여 이런 가능성을 시사하였다. 따라서 비-부비동종양 역시 종양의 악성화(malignant transformation)와 이에 따른 종양세포의 Fas-L생성이 Fas를 갖는 TIL의 고사를 유도하여 결국 숙주면역체계의 면역감시기전(immune surveillance)을 우회하는 것으로 판단되나 추후 좀더 많은 사례를 통한 연구가 필요하리라 사료되었다.
   한편 세포고사지수와 예후와의 관련성을 살펴보면, Hotz 등¹⁸⁾은 두경부암에서 세포고사지수가 낮은 군에서 좋은 예후를 보였고 높은 군에서는 불량한 예후를 보여 세포고사가 중요한 예후 결정인자로 작용한다고 하였으나 여러 세포고사 조절인자와의 연관성은 없다고 하여 세포고사에 관여하는 인자들의 다양성을 시사하였다. 본 연구결과에서도 반전성 유두종군에서 8.30, 반전성유두종중 이형성이나 악성종양을 동반한 군에서는 5.22, 편평세포암에서 3.66으로 종양의 악성화가 진행될수록 세포고사지수가 상대적으로 높게 나타나 종양의 악성도의 척도로의 가능성을 시사하였으나, 여러 임상적 변수들과 세포고사지수와의 상관성은 없었다. 이점은 좀 더 많은 증례를 통한 연구가 필요할 것으로 사료되었다. 또한 FasL와 bcl-2의 상관분석 및 여러 임상적 변수와의 비교시 모두 통계적 의의가 없었다. 그러나 Fas-L와 bcl-2가 반드시 상관관계 또는 역 상관 관계가 형성되어야 할 필요는 없으므로 이는 종양의 형성 및 악성화에 이들 두 인자가 관여하지만 서로간에 특이한 유기적 관계는 아닐 것으로 해석된다. 한편 종양의 경우는 종양세포의 세포질 내에서 주로 양성을 보이는 것과는 대조적으로 정상점막의 경우는 매우 제한적으로 상피의 내강연(luminal free border)을 따라 제한적으로 발현되었다. 이는 아마도 정상적인 세포에 존재하는 Fas/Fas-L의 위치, 양, 기능이 염색양상에서 차이를 보이듯이 종양세포에서는 어떤 원인에 의해서 달라지는 것으로 판단되었다.

결     론

   본 연구결과 비-부비동 종양의 세포고사 조절과정에 bcl-2와 Fas-L가 관여하며, bcl-2 보다는 Fas-L역할이 더 크다고 판단되었다. 특히 Fas-L의 경우 종양의 악성화와 세포고사지수 간에 역 상관관계를 보여 이는 비-부비동 종양이 면역 반응을 피해 종양발생에 중요한 역할을 한다는 Fas counterattack theory를 뒷받침하는 결과를 시사한다고 볼 수 있으나 이를 증명하기 위해서는 좀 더 많은 증례를 통한 분자생물학적 분석방법이 필요하리라 사료된다.

1. Kikuchi Y, Dinjens WN, Bosman FT. Proliferation and apoptosis in proliferative lesions of the colon and rectum. Virchows Arch 1997;431:111-7.

2. Tsujimoto Y, Finger LR, Yunis J, Nowell Pc, Croce CM. Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cell with t (14:18) chromosome translocation. Science 1984;226:1097-9.

3. Lu QL, Poulsom R, Wong L, Hanby AM. Bcl-2 expression in adult and embryonic nonhematopoietic tissues. J Pathol 1993;169:431-7.

4. Pezzella F, Turley H, Kuzu I. Bcl-2 protein in nonsmall cell lung carcinoma. N Eng J Med 1993;329:690-4.

5. Doglioni C, Dei Tos AP, Laurino L, Chiarelli C, Barbareschi M, Viale G. The prevalence of bcl-2 immunoreactivity in breast carcinomas and its clinicopathological correlates, with particular reference to estrogen receptor status. Virchows Arch 1994;424:47-51.

6. Schneider P, Bodmer JL, Holler N, Mattmann C, Scuderi P, Terskikh, A, et al. Characterization of Fas (Apo-1, CD95)-Fas ligand interaction. J Biol Chem 1997;272:1827-33.

7. Wright PA, Quirke P, Attanoos R, Williams GT. Molecular pathology of gastric carcinoma: Progress and prospects. Human Pathol 1992;23:848-59.

8. O’Conell J, Bennett MW, O’Sullivan GC, Collins JK, Shanahan F. The Fas counterattack: A molecular mechanism of tumor immune privilege. Mol Med 1997;3:294-300.

9. Shiraki K, Tsuji N, Shioda T, Isselbacher JK, Takahashi H. Expression of Fas ligand in liver metastases of human colonic adenocarcinomas. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94:6420-5.

10. Bennett MW, O’Connell J, O’Sullivan GC, Brady C, Roche D, Collins JK, et al. The Fas counterattack in vivo: Apoptotic depletion of tumor infiltrating lymphocytes associated with Fas ligand expression by human esophageal carcinoma. J Immunol 1998;160:5669-75.

11. Bennett MW, O’Connell J, O’Sullivan GC, Roche D, Brady C, Kelly J, et al. Expression of Fas ligand by human gastric adenocarcinomas: Potential mechanism of immune escape in stomach cancer. Gut 1999;44:156-62.

12. Kormeyer SJ. Bcl-2 initiated a new category of ongogenesis: Regulator of cell death. Blood 1993;80:879-86.

13. Bishop JM. The molecular genetics of cancer. Science 1987;235:305-11.

14. Friedman M, Grey P, Venkatesan TK. Prognostic significance of Bcl-2 expression in localized squamous cell carcinoma of the head and neck. Ann Otol Rhinol Laryngol 1997;106:445-50.

15. Hellquist HB, Sundelin K, Di Bacco A, Tytor M, Manzotti M, Viale G. Tumor growth fraction and apoptosis in salivary gland acinic cell carcinomas: Prognostic implications of Ki-67 and bcl-2 expression and of in situ end labelling (TUNEL). J Pathol 1997;181:323-9.

16. Gallo O, Boddi V, Calzolari A, SImonetti L, Trovati M, Bianchi S. Bcl-2 protein expression correlates with recurrence and survival in early stage head and neck cancer treated with radiotherapy. Clin Cancer Res 1996;2:261-7.

17. Sheu LF, Chen A, Meng CL, Ho KC, Lin FG, Lee WH. Analysis of bcl-2 expression in normal, inflammed, dysplastic nasopharyngeal epithelia, and nasopharyngeal carcinoma: Association with p53 expression. Human Pathol 1997;28:556-62.

18. Hotz MA, Bosq J, Zbaeren P, Reed J, Schwab G, Krajewski S, et al. Spontaneous apoptosis and the expression of p53 and bcl-2 family proteins in locally advanced head and neck cancer. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1999;125:417-22.