서     론

   중이 진주종이란 점막으로 구성된 중이강내를 각화된 편평상피가 침입하여 각화성 편평상피가 과증식되어 케라틴을 축적시키면서 주위의 골조직을 파괴하는 염증성질환으로 만성화농성 중이염과 달리 임상적으로 난청, 두개내합병증, 안면신경마비, 내이염 등 심각한 합병증을 유발하여 근치적인 수술요법을 필요로 하고 약물치료 등의 보존적 방법으로는 치료가 되지 않는 난점을 가지고 있다.
   진주종은 조직학적으로 피부조직과 유사하게 각질형성 중층편평상피로 맨 아래쪽부터 기저층, 극상층, 과립층, 각질층의 네층으로 되어있는 기질(matrix)과 상피하 결체조직인 주변기질(perimatrix)로 구성되어 있다.
   진주종의 병인에 대한 면역조직화학적 연구결과로 Wullstein과 Wullstein¹⁾이 진주종에서 기저세포의 증식이론을 제시한 이래 증식능력을 가진 기저세포 수의 증가를 확인하였고 기저세포와 인접하고 있는 기저상부세포의 증식능력이 상실되지 않고 남아 있음이 밝혀졌으며²⁾ 진주종의 과각질화 현상은 기저세포와 기저상부세포의 과다증식으로 인한 것으로 알려져 있다.³⁾
   All-trans-retinoic acid(이하 t-RA로 약함)는 retinol(비타민 A)의 자연적인 대사물로 이 약물이 세포의 분화, 증식, 그리고 배아의 발달에 미치는 영향에 대한 많은 연구가 되어 왔고, 한편 이상 각화증의 치료에 t-RA의 유용성이 보고되어 왔으며, 전암성 편평세포의 이동성과 증식성을 억제하면서 정상 편평세포의 성장과 증식을 촉진시키는 능력이 있는 것으로 알려져 있다.⁴⁾
   또한 retinoids는 악성종양의 예방과 치료에 대한 잠재적인 역할로 최근 주목 되고 있는데 이는 retinoids의 증식억제 기능과 세포의 이상분화를 억제하는 기능에 기인하는 것으로 알려져 있다.⁵⁾⁶⁾
   체외에서 배양한 각질형성세포의 성장과 분화에 미치는 t-RA의 효과에 대한 연구는 단층 배양한 각질형성세포를 사용하여 이미 많이 이루어진 바 있으나⁷⁾ 진주종에 대한 t-RA의 영향을 연구한 보고는 미미하다.
   진주종은 신생물은 아니지만 효소에 의한 골파괴와 이동성 등⁸⁾ 신생물에 흔한 특성을 공유하고 있으며 retinoids는 정상 각질형성세포의 증식과 성장은 촉진시키면서 전암성 각질형성세포의 이동과 증식은 억제하는 능력이 보고되어왔던 바⁴⁾ in vitro에서 retinoids가 중이 진주종배양에 미치는 영향을 연구한 보고는 진주종의 이동성(en mass migration)과 분화에 미치는 영향에 관한 것으로 제한되어 있었으며 retinoids가 진주종세포의 증식에 미치는 영향을 분석한 연구보고는 문헌상 찾아볼 수 없었다.
   이에 본 연구에서는 retinoids가 진주종 각질형성세포의 증식에 미치는 영향을 분석하여 진주종의 보존적 치료제로서 국소적 retinoids의 이용 가능성을 모색하기 위해 연구를 계획하였다.

재료 및 방법

대상 및 재료
   1999년 3월부터 1999년 7월까지 경희대학교 의과대학 부속병원 이비인후과에서 진주종성 중이염으로 수술 받은 환자에서 수술시 채취한 진주종 조직을 대상으로 하였다. t-RA는 Sigma사(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 10^-9M, 10^-8M, 10^-7M, 10^-6M농도로 희석하여 사용하였다.

방  법

진주종 각질형성세포의 조직배양(cholesteatoma keratinocyte explant culture)
   진주종 수술시 채취된 다수의 진주종 조직을 즉시 penicillin 100 IU/ml과 streptomycin 100 μg/ml, amphotericin-B 2.5 μg/ml이 첨가된 phosphate buffered saline(Sigma Chemical Co., USA, 이하 PBS로 약함)에 담가 무균조작 bench로 옮긴후 현미경하에서 수작업을 통해 microscissors를 이용하여 keratin debris를 제거한 후 기질부를 1 mm³ 크기의 조직단편으로 만들었다. 이 조직단편들을 PBS용액으로 다시 3~4회 세척한 뒤 keratin growth supplement(KGS)가 첨가된 M-154 무혈청 배양액(Cas-cade Biologics Inc., Portland, Oregon, USA, 이하 M154)으로 1주간 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 6 well plate에 배양하여 진주종 각질형성세포가 증식하여 well plate 바닥에 부착된 것이 확인된 한 환자의 진주종조직에서 얻어진 1예를 실험재료로 이용하였다. Sample은 control group 및 각 retinoic acid의 농도별로 2개 이상의 sample이 되도록 하였으며 이후 3주간 explant culture를 지속하였다. 배양액은 3일마다 교환하였고 1주 단위로 세포배양의 경계를 marking pen을 이용하여 표시 하였다.

t-RA 처리
   t-RA는 dimethylsulfoxide(DMSO)에 녹인 stock solution을 사용하였는데 진주종 explant culture 1주째 배양조직이 6 well plate 바닥에 부착되었을때 배양액에 10^-9 M, 10^-8M, 10^-7M, 10^-6M농도로 t-RA를 첨가하였다. 대조군은 t-RA를 첨가하지않고 final concentration 0.1%의 DMSO가 첨가된 상태로 실험군과 비교하였다.

형태학적 관찰 및 측정
   조직배양중 도립현미경하에 각질형성세포가 배양됨을 관찰할 수 있었고 6 well plate 바닥에 marking pen으로 세포배양의 경계를 배양 1주, 2주, 3주, 4주에 각각 표시한 후 트레이싱 페이퍼에 복사하여 영상분석기(Multiscan, AAB, Fullerton, CA, U.S.A.)를 이용하여 증식배양된 면적을 측정하였다(Fig. 1).

통계 처리
   영상분석기로 측정된 면적을 SAS시스템의 repeated measures analysis of variance 통계 프로그램을 이용하여 시간상수에 의한 영향을 배제하여 분석하였다.

결     과

   수술시 채취된 진주종 시료중 1주간 성공적으로 배양된 explant culture에 t-RA를 첨가하지않고 DMSO만 첨가된 대조군과 배양액에 10^-9M, 10^-8M, 10^-7M, 10^-6M농도로 t-RA가 처리된 실험군으로 구분하여 각각의 경우로 2개의 개체씩 12개의 배양 sample을 6 well plate에 4주간 성공적으로 배양하였다.

형태학적 관찰

육안적 소견
   6 well plate에서 1주간 배양되어 6 well plate 바닥에 부착된 explant culture의 증식된 경계를 marking pen으로 표시 하였으며 이후 1주, 2주, 3주째 배양된 경계를 표시 하였는데 대조군에서는 왕성한 증식배양을 관찰할 수 있었으나 t-RA로 처리한 경우에는 전반적으로 t-RA의 농도가 증가할수록 증식이 더욱 억제되는 양상을 보였다(Table 1).
   또한 진주종 각질형성세포의 특유한 현상인 이동성으로 인한 영향으로 시간경과에 따라 증식배양된 경계가 동심원을 그리지 않고 편향됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 1).

현미경 소견
   진주종 각질형성세포의 조직배양중 현미경 관찰시 explant culture에서 각질형성세포가 배양됨을 관찰할 수 있었으며 진주종 각질형성세포 특유의 현상으로 이동성의 leading edge에서 증식방향을 선도하는 lamellipoda를 보여 진주종 각질형성세포증식의 방향성을 관찰 할 수 있었다(Fig. 2A).
   t-RA투여에 따른 각질형성세포의 형태학적 변화의 차이는 광학현미경상 관찰할 수 없었다(Fig. 2B).

세포배양 면적 측정

   6 well plate 바닥에 표시된 세포배양증식의 경계를 트레이싱 페이퍼에 복사하여 영상분석기(Multiscan, U.S.A.)를 이용하여 2차원적으로 증식배양된 면적을 mm²단위로 측정하였는데 대조군에서의 평균 배양면적은 배양 2주, 3주, 4주에 각각 41.2, 167.5, 401.5 mm²였으며 t-RA를 10^-8M투여시 배양 2주, 3주, 4주에 각각 59.6 mm², 117.5 mm², 224.0 mm²로 t-RA투여 2, 3주째에는 각각 대조군 배양면적의 70.1%, 55.8%로 배양면적의 감소를 보였다. t-RA를 10^-6M농도로 투여시에는 각각 29.0 mm², 70.1 mm², 94.4 mm²로 대조군 배양면적의 70.4%, 41.8%, 23.5%로 현저한 배양면적의 감소를 관찰 할 수 있었으며 SAS시스템의 repeated measures analysis of variance를 이용한 통계분석상 t-RA투여시 진주종 각질형성세포의 배양증식면적은 의미있는 감소를 보였다(p<0.05)(Table 1).

고     찰

   진주종의 상피는 정상 표피보다 상피층이 얇고 표피층이 감소되어 있으며 각질층이 두껍고 일부에서는 각질층에 핵이 발견되기도 하는데 이는 그 상피층이 병적으로 과도한 증식을 하고 있음을 의미하는 것으로 생각된다.
   정상피부는 분화와 증식이 균형을 이루어 상피세포층을 유지하게 된다. 즉, 세포분화는 항상 세포증식과 상반된 보완관계를 유지하며, 세포의 증식도가 증가하게 되면 분화는 미분화상태로 남게 된다. 소위 상피세포의 항상성이 이러한 양자간의 균형에 의해서 유지되나 만약 그 균형이 깨어지면 세포의 과증식 경향이나 분화의 가속현상이 기저상층에서 나타날 수 있다.⁹⁾
   정상상피에서는 증식과 분화의 균형이 autocrine과 paracrine을 통한 성장촉진과 성장억제 및 분화조절인자에 의해 유지된다.¹⁰⁾ 이러한 인자의 생성이나 활성화의 변화로 과증식이 발생될 수 있는데 건선의 경우 TGF-α와 interleukin 6의 증가가 과증식반응에 관여되는 것으로 보여지는데¹¹⁾ 이와 유사한 기전이 진주종에서도 관여하여 증식과 분화의 균형이 깨어져 세포의 과증식 경향으로 진주종 상피세포에서의 과도한 각질합성이 발생되리라 생각된다. 이에 대한 면역조직화학적 연구결과를 종합해 보면 먼저 진주종의 과증식 성향에 대한 연구에 있어서 Wullstein과 Wullstein¹⁾이 진주종에서 기저세포의 증식이론을 제시한 이래 증식능력을 가진 기저세포 수의 증가를 확인하였고 기저세포와 인접하고 있는 기저상부세포의 증식능력이 상실되지 않고 남아있음을 cytokeratin과 cytokine 등을 통한 면역조직화학적 연구에서 확인되었다.²⁾ 그리고 진주종 상피에서 특징적으로 보여지는 과각질화 현상은 기저세포와 기저상부세포의 과다증식으로 인한 것으로 알려져 있으며,³⁾ Stammberger 등¹²⁾은 involucrin과 filaggrin 분화인자를 이용한 면역조직화학적 연구에서 기저상부세포에서의 조기분화를 확인하였으며 진주종에서 표피의 빠른 증식 표식자로 알려진 keratin 16의 발현이 외이도 피부보다 분명히 증가되었고 증식능과 밀접한 관련성을 갖는 very late antigens-3(VLA-3)가 정상표피에는 발현되지 않지만 진주종세포에서는 발현이 증가되어 진주종에서 증가된 증식성을 확인하였다.
   In vivo와 in vitro에서 표피의 각질형성세포의 증식과 분화는 몇몇 펩타이드 성장인자, 칼슘이온, phorbol esters, retioids, cytokines등 다양한 요인들에 영향을 받는 것으로 알려져 있고¹³⁾ 경험적으로 retinoid는 상처치유에 중요한 작용을 하리라 생각되어져 왔으며 당단백질 생산에 중요하고 세포막의 당­인산염 화합물의 통과에 수송체로 작용하는 것으로 알려져 있다.¹⁴⁾
   Retinoids는 스테로이드와 갑상선과 같은 계열의 RARα, RARβ, RARγ로 명명된 핵내에 위치한 수용체에 작용함이 밝혀졌으며¹⁵⁾ 이를 통해 생물학적 작용이 나타나는 것으로 알려져 있는데 인체 표피 각질형성세포의 증식에 대하여 촉진 혹은 억제작용을 가진 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾
   진주종은 신생물은 아니지만 신생물에 흔한 특성을 공유하고 있으며 retinoids는 발암 전구물질을 대사시키는 여러 가지 약물대사 효소의 활성도와 유전자 발현을 증가시킴으로써 암발생 유전자의 발현을 억제하여 악성종양의 예방과 치료에 대한 잠재적인 역할이 기대되고 있다.⁵⁾
   Retinoids는 in vivo와 in vitro에서 표피 각질형성세포의 분화와 증식에 뚜렷한 영향을 보임이 보고되어 왔지만 retinoids의 작용기전에 대하여는 잘 알려져 있지 않다. Retinoids의 각질형성세포에 대한 증식 조절작용은 각질형성세포에 직접적인 작용과 진피나 염증세포에서 생성되는 성장조절인자의 측분비량의 변화에 의한 간접적인 작용이 작용하리라 생각되어진다.¹⁰⁾
   중이 진주종에 대한 t-RA의 영향에 대한 연구는 미미하였는데 이는 진주종의 배양이 시료채취 양의 제한, 감염의 동반 및 진주종세포에 적절한 환경조성의 어려움이 있었기 때문이다. 본 연구에서는 진주종 채취시 골조직에 부착된 기질부위가 최대한 확보되도록하여 제한된 시료의 양으로 인한 배양실패를 줄이도록 하였고 중이 진주종에 흔히 동반되는 감염으로 인한 세균의 오염을 방지하기 위해 조직배양시 penicillin 100 IU/ml, streptomycin 100 μg/ml, amphotericin-B(Fungizone^®)가 첨가된 PBS용액으로 3~4차례 세척하여 감염으로 인한 배양실패를 줄이도록 하였는데 이는 Proops와 Parkinson¹⁶⁾이 사용한 방법과 같다. 또한 각질형성세포의 선택적 배지인 keratinocyte growth supplement(KGS)가 첨가된 M-154 무혈청 배양액에 진주종조직을 배양하여 섬유아세포, 멜라닌세포 등이 증식되기 어려운 환경으로 광학현미경상 섬유아세포, 멜라린세포와 모양이 구분되는 전형적인 각질형성세포가 증식됨을 관찰할 수 있었다.
   문헌상 in vitro에서 진주종세포의 배양에 미치는 t-RA의 영향에 관한 보고는 주로 진주종에서 특징적으로 나타나는 이동성에 관한 것으로⁵⁾¹⁷⁾ Minotti 등⁵⁾은 진주종의 이동성이 retinoids투여로 억제됨을 관찰하여 진주종 상피세포의 adhesion의 감소와 cytoskeleton의 변화 두 가지의 기전이 진주종의 이동성을 억제하는데 관여할 것으로 보고 하였다. 본 연구에서는 in vitro에서 진주종배양시 진주종 기질세포의 이동성에 대한 영향으로 보이는 불규칙한 모양의 세포배양 증식경계면을 육안적으로 관찰할 수 있었으며 광학현미경 소견상 migration의 leading edge에서 증식방향을 선도하는 lamellipoda가 관찰되었으며 t-RA투여시 농도증가에 따라 세포증식의 경계면이 동심원에 가까워짐이 관찰되어 이동성이 떨어짐을 알 수 있었다.
   t-RA의 배양 각질형성세포에 대한 영향은 증식을 촉진시키고 분화는 억제한다고 알려져 있으며 t-RA가 각질형성세포의 배양에 미치는 영향으로 10^-5M농도의 t-RA에 각질형성세포를 배양시 약 5일후 각질형성세포가 괴사되었으며 10^-7M농도와 10^-6M농도의 t-RA에 배양시 계속적인 증식을 보였고 전자현미경 관찰상 t-RA는 각질형성세포의 세포간 접착을 약하게 하는 형태변화를 초래 하였으며 교소체 단백의 생성을 감소시켰음이 보고 되었다. Retinoids는 nanomolar 농도의 낮은 농도에서 각질형성세포의 분화표식자의 발현을 억제함이 알려져 있으며 retinoids의 영향은 효과적인 조직에서의 약물농도(effective tissue concentration)와 수용체에 대한 친화성의 2가지 요인이 작용할 것으로 알려져 있으나 retinoids가 상피세포의 증식을 촉진하거나 억제하는 기전에 대하여는 아직 잘 알려져있지 않다.¹⁸⁾
   Retinoids는 세포배양에 필요한 인자이므로 부적절한 환경에서 배양된 각질형성세포에 retinoids를 추가하면 증식을 촉진시킬 수 있겠지만 적절한 농도이상에서는 각질형성세포의 증식을 억제 및 괴사시키는 것으로 보여진다. 본 연구에서는 t-RA투여시 광학현미경상 중이 진주종 각질형성세포의 형태학적 변화를 관찰할 수 없었다.
   진주종의 병태생리상 이동성과함께 증식성이 병태생리에 크게 관여하리라 사료되는데 t-RA가 진주종의 증식에 미치는 영향에 대한 보고는 문헌상 찾아볼 수 없었다. 본 연구에서 t-RA가 진주종 각질형성세포의 증식억제에 대한 영향을 배양표면적으로 측정하였는데 본 실험에서 1 mm³ 크기로 자른 진주종조직을 6 well plate에 부착시 초기 2~3일간 multilayered tissue fragment에서 각질형성세포가 조직 주위로 migration함을 관찰할 수 있었으며 배양 2~3일 이후부터는 cell doubling으로 증식됨이 관찰 되었다. 세포층은 배양 경계가 well plate벽에 다다르기 전까지는 단층을 형성하며 세포사이의 빈틈은 거의 없었으므로 배양된 면적을 측정하여 증식억제를 판단하였다. 본 실험에서 t-RA는 10^-8M농도에서 진주종의 증식성에대한 의미있는 증식억제를 보였으며 이러한 효과는 10^-7M농도에서 유사하였고 10^-6 M농도에서 현저한 증식억제효과를 보여 진주종기질세포가 t-RA의 증식억제작용에 대해 감수성이 높음을 알 수 있었다. t-RA는 10^-7M농도 이하에서는 진주종 각질형성세포에 대한 의미있는 증식억제효과가 배양 2주이후에 나타났는데 이는 배양 1주째는 배양면적에 비해 상대적으로 큰 표준편차와 cell migration의 영향으로 통계적 의미가 없게된 것으로 사료된다. 이러한 결과는 t-RA가 진주종의 이동성을 억제함을 보고한 기존의 연구결과와 더블어 진주중의 증식성을 의미있게 억제하는 t-RA의 효과를 밝혀 앞으로 진주종의 보존적 치료제로 t-RA의 역할가능성을 시사한다 하겠다. 다만 본 연구에서는 정상 각질형성세포 배양에 미치는 t-RA의 영향에 관한 대조군 실험이 생략되어 정상 각질형성세포에 대한 대조군 실험의 필요성이 제기 되었다.
   한편, t-RA는 경구투여시 치료적 약물농도에서도 기형유발 등 상당한 부작용이 나타나지만 국소적 투여시 혈장의 t-RA나 t-RA의 대사물질의 농도증가가 나타나지 않는 것으로 보고되어 국소투여는 경피투과성이 미미한 것으로 알려져 있고 전신적 부작용이 없는 것으로 알려져 있다.¹⁹⁾ 따라서 t-RA의 국소투여시 충분히 높은 농도의 이점액제제로 사용할 수 있으리라 생각된다. 또한 최근 RARα에 선택적으로 결합하는 adapalene(Differin^®)등 피부에 선택적으로 작용하는 retinoids의 개발로 retinoids의 부작용을 한층 줄여주는 계기가 되어 진주종 치료제로서 t-RA의 가능성을 더한층 높여 주었다.

결     론

   중이수술중 진주종조직을 채취하여 진주종 각질형성세포의 explant culture시 전암성세포의 증식과 이동성을 억제하는 것으로 알려진 t-RA를 투여함에 따라 t-RA의 증식억제효과는 농도가 증가함에 따라 증식억제가 뚜렷하였는데 10^-8M농도와 10^-6M농도에서 현저한 증식억제 효과가 관찰 되었다. 이러한 결과는 t-RA에 대한 진주종 각질형성세포의 반응성이 민감함을 시사하며 retinoic acid가 진주종 각질형성세포 배양의 이동성을 억제시킨다는 기존의 연구결과와 더불어 장래 진주종성 중이염의 보존적치료제로서 retinoic acid의 이용가능성을 높여주었다. 향후 인체내와 유사한 환경조성을 가지는 진주종 각질형성세포의 3차원적 배양에서 retinoids가 진주종세포의 증식과 이동 및 분화에 미치는 영향을 분석하는 연구와 면역조직화학적 검사를 통한 배양세포의 동정 및 이독성에 대한 연구가 필요하리라 사료된다.

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