서     론

   악성 종양의 치료 방침 결정과 예후를 판정하기 위해 종양의 생물학적 특성을 알아내기 위한 많은 연구가 행해지고 있다. 현재까지 가장 흔히 임상에서 악성종양의 예후 예측인자로 사용되고 있는 것이 종양의 크기, 림프절 전이, 원격 전이 등으로 구분한 병기 판정과 세포의 분화도 등이다. 최근 면역학적, 생화학적인 분야의 발전으로 악성 종양의 특성을 분자유전학적인 측면에서 연구해 보고자하는 노력이 활발히 진행되어 암종의 생성과 성장, 전이에 관계되는 여러 유전자와 물질들이 밝혀지고 있다.
   E-cadherin은 세포의 경막에 위치하는 단백질 분자로 세포의 형태결정과 세포와 세포 사이의 유착에 관여한다.¹⁾ 여러 실험에서 E-cadherin 항체의 처리에 의해 E-cadherin을 파괴시키고 나면 세포의 형태가 섬유아세포 모양으로 변하고 세포간의 유착력이 약화되어 주위 겔로의 침습력이 증대된다고 보고되었다.²⁾ 따라서 암종의 주변조직으로의 침습과 전이의 기전을 이해하는데 E-cadherin에 대한 연구가 많이 행해지고 있다. 이미 여러 연구에서 E-cadherin의 상실이 인체의 각종 악성 종양(위암, 전립선암, 유방암, 자궁경 부암 등)에서 나타난다는 것이 밝혀졌고, 임상적인 예후와도 연관된다는 보고가 많다.³⁾⁴⁾
   두경부 영역에 발생하는 악성종양은 그 대부분이 편평세포암종으로 E-cadherin 발현의 변화가 침습과 전이 과정에 크게 연관될 것이라 여겨지며 그 예 후 판정에도 도움을 주는 인자라고 생각된다. 따라서 본 연구에서는 두경부 영역에 발생한 편평세포암종 환자의 조직에서 E-cadherin의 발현 양상을 살 펴보고 기존의 예후 판정의 주된 기준이었던 TNM 분류체계와 비교하여 상관 관계를 조사하여 E-cadherin이 두경부 편평세포암종의 예후 판정의 인자로서의 가치가 있는지를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

대상조직
   1993년부터 1998년까지 5년 동안 본 이비인후과에서 두경부 악성 종양으로 수술적 치료를 시행한 후 조직학적으로 편평세포암으로 진단 받은 환자 29명을 대상으로 하였다. 수술전 방사선치료나 화학치료를 받은 과거력이 있는 사람은 대상에서 제외시켰다. 대상 조직은 수술시 적출된 원발부위 암종으로 포르말린에 고정된 후 파라핀에 포매된 조직을 사용하였다.

광학현미경적 관찰

   광학현미경을 이용하여 한 명의 병리학자에 의해 병리조직학적으로 검색하여 진단명을 확정한 후 암종의 분화도를 고분화(well differentiated), 중등도 분화(moderately differ-entiated), 미분화(poorly differentiated)로 분류하였다.

병기적용

   병원 기록과 방사선 검사를 토대로 종양의 크기, 림프절 전이, 원격 전이에 따른 AJCC(97) 분류로 구분하였다.

면역조직화학적 관찰

   파라핀에 포매된 조직을 5 μm 두께로 절편하여 37°C에서 밤새 건조시키고 xylene에서 10분간 2회 탈파라핀 시킨 뒤 100%와 95% alcohol을 이용하여 각각 3분씩 재함수를 시켰다. 항원성의 회복을 위하여 pH 6.0의 citrate 완충액에 침수시킨 후 650와트에서 5분간 2회 전자렌지에서 가열 처리한 후 실온에서 식히고 증류수에 수세하였다. 실온에서 10분간 PBS(phosphate buff ered saline)에 배양 후 조직내 내인성 peroxidase 활성을 차단하기 위하여 3% hydrogen peroxide에 10분간 반응시켰고, 비특이적인 단백과의 결합을 방지하기 위하여 10% goat serum으로 10분간 반응시킨 후 따라버렸다. 그 후 증류수로 수세하고 phosphate buffered saline(PBS)에 5분간 담근 후 아래에 서술한 단백분해효소 1차 항체를 37°C에서 30분간 반응시켰다. PBS에 2분간 3번씩 수세한 후 2차 항체를 37°C에서 30분간 반응시켜 다시 PBS로 수세하였고, streptavidinbiotin peroxidase complex로 실온에서 5분간 반응 시킨 후 다시 PBS로 수세하였다. 3-aminoethyl 9-carbasol(AEC)로 실온에서 15분간 발색시키고 증류수로 2분씩 3회 세척한 다음 Meyers hematoxylin으로 대조 염색한 뒤 crystal mount로 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다. 음성 대조로는 1차 항체를 생략한 채 위의 과정을 반복하여 그 면역양상 양상을 확인하였다.

E-cadherin
   E-cadherin에 대한 쥐의 단클론성 항체(Zymed, Sanfrancisco, CA)를 1：100으로 희석하여 사용하였다. 내부 대조(internal control)로 암종의 침범이 없는 정상 상피조직의 슬라이드를 염색하여 탐식세포에서의 반응을 양성대조로 하였다. E-cadherin은 양성 대조군과 같은 형태로 세포막을 따라 균일하게 염색이 된 경우와 균일하게 음성을 보이는 경우, 두 가지가 혼재되어 있는 양상으로 발현되었으며, 본 연구에서는 균일하게 염색된 경우와 일부 혼재되어 있는 경우를 양성으로 판정하였고(Fig. 1), 그렇지 않은 경우를 음성으로 판정하였다(Fig. 2). 모든 면역염색 조직은 한 명의 병리학자에 의해 광학 현미경으로 관찰되었다.

통계학적 검증
   Mann-Whitney U test를 사용하여 검증하였고 유의성은 0.05이하로 하였다.

결     과

원발 병소와 E-cadherin의 발현과의 연관성

   환자들의 원발 병소별 구분으로 성문상부암이 16예, 성문암이 7예, 그 외 상악동암이 3예, 구강암이 3예이었고 상악동암과 구강암을 제외하고 성문상부암과 성문암에서의 E-cadherin의 양성 발현은 통계학적으로 의미 있는 차이를 보이지 않았다(p＝0.803)(Table 1).

E-cadherin과 T stage의 비교

   원발병소의 주위 침범정도에 따라 구분한 T stage에 따른 E-cadherin의 양성 발현은 T₁ 6예 중 5예, T₂ 10예 중 5예, T₃ 10예중 4예, T₄ 3예에서는 0예로, T stage가 낮을수록 양성 발현을 보인 예가 많았다(p＝0.025)(Table 2).

E-cadherin과 N stage의 비교

   주위 경부 임파조직으로의 전이 정도에 따른 N stage와 E-cadherin의 양성발현 정도의 비교는 N 0 16예 중 11예, N 1 7예 중 2예, N 2 5예 중 1예, N 3 1예 중 0예로, N stage가 낮을수록 양성 발현을 보인 예가 많았다(p＝0.015)(Table 3).

E-cadherin과 세포 분화도의 비교

   고분화, 중등도분화, 미분화로 구분한 세포 분화도에 따른 E-cadherin의 양성발현은 고분화형 12예 중 9예, 중등도 분화형 12예 중 5예, 미분화형 5예 중 0예에서 나타나, 분화도가 높을수록 양성 발현을 보인 예가 많았다(p＝0.005)(Table 4).

고     찰

   악성종양의 발생과 진행에는 다단계에 걸친 여러 인자들이 관여한다고 알려져 있다. 최근에 행해지고 있는 많은 유전학적, 분자 생물학적인 연구들은 암의 단계별 진행과정에 관계되는 유전자나 유전자물질 등을 밝혀내고 있다. 종양의 주위 침습력과 전이력은 암 환자의 치료 예후에 큰 영향을 미치는데, 세포간의 접착력의 감소로 인한 주위 기질과 혈관으로의 암세포의 전이가 악성종양의 진행에 있어 중요한 단계로 여겨져 세포접착분자들에 대한 연구가 활발히 진행되는 중이다.
   E-cadherin은 상피조직에 특이적으로 존재하는 칼슘 의존성 세포접착분자로 120 kDa의 경막 단백질이다.¹⁾ 여러 가지 알려진 세포의 접착분자들 중 칼슘 의존성인 cadherin군이 비칼슘 의존성인 integrin, immunoglobulin, selectin들에 비해 세포 접착에 관여하는 정도가 더 크고 세포변형에도 더 큰 영향을 미친다고 알려졌고,⁵⁾ 네 가지의 cadherin subgroup중 상피세포 접착분자인 E-cadherin(epithelial cadherin)이 상피세포의 형태학적 특성과 구조 유지에 중요한 역할을 하므로 그 외의 P-cadherin(placental cadherin), N-cadherin(neural cadherin), liver cell adhesion molecule(L-CAM) 보다 악성 종양의 진행과정의 이해에 더 도움을 주는 인자라고 여겨진다.¹⁾⁶⁾ 
   E-cadherin의 발현은 상염색체 16q22와 연관되어⁷⁾⁸⁾ 두경부의 편평세포암종에서 염색체의 전위가 관찰되었고,⁹⁾ 전립선암, 유방암, 간암 등의 경우에는 대립유전자 결손이 보고되었다.⁴⁾ 
   실험실 세포배양 실험에서 암세포는 정상상피세포와 비교하여 방추형 섬유아세포모양으로의 세포 모양 변화, 세포 운동성의 증가, 억제되지 않는 세포성장(anchorage-independency growth), 세포막의 유착력 변화 등이 관찰되었다.²⁾ 또 실험적으로 E-cadherin 항체를 변성시켰을 때 세포가 상피세포로서의 특성을 소실하고, 세포외 기질이나 태아 심조직으로의 침습이 증대되는 것을 관찰하였다.¹⁰⁾¹¹⁾ 
   E-cadherin은 세포막에 걸쳐 위치하여 세포내 영역은 α-catenin, β-catenin, γ-catenin과 complex를 형성한 후 세포의 액틴 섬유와 결합하게 되므로³⁾ 세포외 영역의 변성뿐 아니라, 세포내의 catenin들의 변화도 E-cadherin의 기능에 변화를 초래하여 세포 접착력과 침습력에 영향을 미치게 된다는 보고도 있으나, 본 연구에서는 catenin의 기능에 대한 실험은 시행하지 않았다.³⁾
   임상적으로도 E-cadherin의 종양억제 단백질로서의 증거를 보고한 연구가 많으며 위암, 유방암, 전립선암, 방광암, 폐암, 결장직장암 등에서 세포의 분화도, 전이도와 반비례하여 E-cadherin의 발현이 관찰되어, 악성 종양의 예후 인자로서 E-cadherin의 유용성이 대두되고 있다.⁴⁾ 두경부 악성 종양에서도 E-cadherin의 발현과 종양의 임상 양상에 관한 연구들이 이루어지고 있는데, 원발 종양 세포의 분화도, 림프절 전이와 down-regulation을 나타낸다는 보고들이 있으나, 또 다른 연구에서는 림프절 전이와는 연관성이 없다는 보고도 있다.^4)5)12)15) 
   본 연구에서는 E-cadherin의 변화가 중요한 역할을 할 것으로 생각되는 두경부 편평세포암종에서, 현재까지 예후 측정에 지표가 되어왔던 TNM 병기와 면역조직화학적 방법으로 측정한 E-cadherin 발현의 연관성을 95% 유의성으로 검증하였다. 다른 연구에서는 E-cadherin의 발현정도에 따라 여러 등급으로 구분한 후 비교분석 하는 방법을 사용하였으나,⁴⁾¹³⁾ 본 연구에서는 대상 환자의 수가 많지 않았으므로 E-cadherin의 발현정도를 세분화하지 않고 음성군과 양성군, 두 그룹으로 나누어 검증하였다.¹³⁾¹⁴⁾ 
   대상환자들의 나이와 원발암의 위치별 구분에 따른 E-cadherin의 발현도는 별다른 상관관계가 없는 것으로 나타났으나,¹²⁾ 본 연구의 대상이 병소별 구분으로는 통계학적으로 충분하지 못하여 좀더 많은 대상에서의 연구가 필요할 것으로 생각된다.
   T 병기에 따른 검증은 T 병기가 증가함에 따라 E-cadherin의 발현도가 떨어졌다고 한 보고와¹²⁾ T 병기와 E-cadherin의 발현도 사이에 유의한 상관 관계를 발견할 수 없다고 한 보고가 있으나,¹⁵⁾ 본 연구에서는 원발 병소의 크기와 침습이 커짐에 따라 의미있게 E-cadherin이 감소함을 알 수 있었다(p＝0.025). N 병기와의 연관성은 원발 종양의 조직 표본을 사용하여 비교한 연구와¹⁶⁾ 침범된 림프절 조직 표본을 사용하여 비교하여 의미를 비교한 연구가 있는데,¹⁷⁾ 상관관계가 없었다고 한 보고와 상관관계가 있다고 한 보고가 있어 보고자마다 차이가 있었다. 본 연구에서는 전이된 림프절 표본이 아닌 원발 종양 조직표본에서의 E-cadherin 발현과 림프전이 여부를 분석하여 통계학적으로 의미있는 상관 관계를 보였다(p＝0.015). 따라서 N stage에 따른 연관성은 원발 종양 조직표본을 사용하여 분석하였는가 아니면 전이 림프절 조직표본을 사용하였는가에 따라 다른 결과가 나타날 수 있다고 생각된다. 본 연구에서는 원발 종양의 세포학적 특성이 림프전이 여부와 더 밀접한 연 관성이 있을 것으로 여겨 원발 종양의 표본만을 사용하여 분석하였는데, 전이 림프절 조직과 비교하여 분석하는 연구가 필요하다고 생각된다.
   세포의 분화도는 keratin pearl의 형성 여부에 따라 고분화, 중등도분화암, 미분화암으로 구분한 후 E-cadherin의 발현을 보았으며, 연관관계가 없다고 한 보고도 있으나¹⁸⁾ 본 연구는 분화도가 나쁠수록 E-cadherin 양성발현이 떨어지는 상관관계를 보였다(p＝0.005).¹⁶⁾¹⁷⁾ 원격전이의 경우는 대상환자가 없었으므로 E-cadherin과의 상관관계는 분석할 수 없었다.
   환자들의 수술 후 생존률과 E-cadherin 발현의 분석은 생존기간 추적이 너무 짧은 경우가 많았고, 추적관찰이 불가능한 환자들이 다수 있어 통계적 의미를 갖지 못하여 본 연구에서는 제외하였다.
   이상의 결과에서 두경부 편평상피암종에서 세포의 분화도와 임상 병기에 따라 E-cadherin의 발현이 유의한 상관관계를 갖는 것으로 나타났으며, 이는 세포막에서의 E-cadherin의 소실이 세포들간의 접착력을 저하시키고 운동성을 증대시켜 암세포의 주위 조직으로의 침습과 전이와 관계된다는 여러 보고와 일치하는 결과이다.

결     론

   이상의 결과로 종양의 생물학적 특성을 예측할 수 있는 예후인자로서 세포접착분자인 E-cadherin의 측정이 의미 있는 검사라고 여겨지며, 아울러 E-cadherin뿐 아니라 다른 접착분자들의 연관관계의 연구도 악성종양의 진행을 이해하기 위해 좀더 많이 진행되어야할 것이다.

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