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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 43(8); 2000 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2000;43(8): 808-812.
Characterization of Cytokines Present in Pediatric Recurrent Otitis Media with Effusion: Comparison of Allergy and Nonallergy.
Chul Ho Jang
Department of Otolaryngology, Wonkwang Medical School, Iksan, Korea. chul@wonnms.wonkwang.ac.kr
소아 재발성 삼출성 중이염에서 Cytokine에 관한 연구:알레르기 유무에 따른 비교
장철호
원광대학교 의과대학 이비인후과학교실
주제어: 소아 재발성 삼출성 중이염Cytokine알레르기.
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Earlier studies documented the presence of several cytokines in middlle ear effusions (MEEs) of humans and experimental animals. Some of these studies reported association between cytokine levels and certain clinical factors. Rut studies on association between cytokine levels and allergy in MEE are very rare. To acertain the role of allergy in the pathogenesis of recurrent otitis media with effusion(ROME) through the characterization of cytokines.
MATERIALS AND METHODS:
MEE samples were collected from patients with allergy (20 ears) and without allergy (15 ears). They were assayed for interleukin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL-4), interleukin-6 (IL-6), and tumor necrosis factor-alpha(TNF-alpha) using sandwich enzyme linked immunosorbent assay.
RESULTS:
The levels of IL-4, IL-6 and TNF-alpha in the allergy group were statistically higher than in the nonallergy group. The level of IL-2 in the allergy group was slightly higher than in the nonallergy group, but the difference was not statistically significant.
CONCLUSION:
Elevation of Th2 driven cytokines and TNF-alpha in MEEs suggests that ROME may be a sign of allergic inflammation in the middle ear.
Keywords: PediatricRecurrentOMECytokineAllergy

서     론


   최근 삼출성 중이염의 발생원인으로 면역학적 기전의 중요성과 관심이 높아지면서 cytokine이 면역학적으로 관련된 물질로 알려지고 있다.
   아직 만성 삼출성 중이염에서 cytokine의 역할에 대한 연구는 주로 삼출액의 성상, 이환기간, 나이, 고막절개 빈도등과 관련하여 cytokine의 농도가 연구되었다.1-4) 만성 삼출성 중이염의 병인의 하나로써 알레르기의 역할에 대한 연구는 Hurst,5) Mogi 등6)에 의해 보고된 바 있으며 국내에서도 Park 등7)에 의해 보고된 바 있다. 그러나 만성 삼출성 중이염에서 알레르기와 관련하여 이루어진 cytokine 연구는 거의 없는 실정이다.
   저자들은 재발성 만성 삼출성 중이염에서 알레르기를 동반한 경우와 동반하지 않은 경우에서 삼출액에 존재하는 대표적인 cytokine인 tumor necrosis factor-alpha(TNF-α), interleukin-2(IL-2), interleukin-4(IL-4), interleu-kin-6(IL-6)의 농도를 측정하여 알레르기 동반 유무와 상관관계를 알아보고자 본 연구를 시행하였다.

대상 및 방법


알레르기 검사
   1998년 2월부터 1999년 8월까지 내원하였던 재발성 만성 삼출성중이염 환자 130명을 대상으로 하여 MAST(multiple allergosorbent test) 검사를 시행하였다. 환자의 연령 분포는 3세부터 12세였으며 평균연령은 6.8세였다. 남녀비는 1:3.5로 여자가 많았다.
   MAST allergy system(MAST immunosystem, USA) 한국형 패널을 이용하여 총 IgE와 35종의 알레르기 항원들에 대한 특이 IgE를 반정량하였다. 먼저 각 항원이 부착되어 있는 MAST pette chamber에 환자의 혈청 1.3 ml를 채우고 실온에서 16~24시간 반응시킨 후 완충용액(10 mM phosphate buffer, pH 7.2, 150 mM NaCl, 1.0 ml Tween 20, 0.1 g Thimerosal in distilled water)으로 3회 씻었다. Horseradish peroxidase가 부착된 염소 항 IgE 항체 용액을 넣고 실온에서 4시간 반응시킨 다음 완충용액으로 3회 세척을 한 후 화학발광물질(photoreagent:reagent A:cyclic diacrylhydraxide in 45.5 mol/L NaOH, reagent B:50 mmol/L borate buffer, reagent C:mixture of erythrosine, Allura Red AC and tartraxine, reagent D:4 mmol/L H2)을 넣고 바로 5개의 chamber를 polaroid photocasette에 넣어 6분간 polaroid 57 high speed film(Kodak Co. USA)에 노출시켰다. 화학발광반응의 결과가 흰색의 선으로 나타나며 densitometer(MAST Immunosystems, USA)를 이용하여 voltage의 정도에 따라 class 0부터 4까지로 판정하였고 class 2 이상을 양성으로 정의하였다.

중이저류액의 채취
   MAST에서 집먼지 진드기에 양성을 보였던 환자 41명 중 20명과 음성이었던 89명 중에서 15명을 대상으로 중이 삼출액을 채취하였다.
   전신마취하에서 외이도를 여러번 세척한 다음 고막 절개를 가하였다. Juhn Tym Taps(Xomed Products, Jacksonville, Flo, USA)를 사용하여 무균적으로 중이삼출액을 수집하였다. 수집된 삼출액에 0.1 M 인산염 완충식염수 1.5 ml를 가하고 2000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 따로 담아 ­70°C 냉동고에 보관하였다.

Cytokines와 총단백량의 정량

   냉동고에 보관하였던 중이 삼출액을 체온으로 녹여서 측정하였다. 총단백량의 측정은 bicinchoninic acid(BCA) 방법으로 BCA kit(Sigma chemical co. St Louis, USA)를 사용하였다. BCA 용액과 4% CuSO4를 50:1로하여 200 ul를 96-well에 loading하였다. 1/10로 희석한 단백질 sample과 표준 용액(bovine serum albumin;0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 mg/ml)을 각각 10 ul를 loading하고 37°C서 30분간 둔 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
   Cytokines 정량은 sandwich 효소면역법(Enzyme-linked-immunosorbent assay:ELISA)으로 kit(R&D system Inc. USA)를 사용하여 측정하였다. Cytokine에 대한 단일클론 항체 1 ug/ml를 PBS(pH 7.4)로 희석하여 96 well plate에 100 ul씩 각각 coating한 다음 4°C에서 12시간 동안 배양하였다. Plate를 0.05% tween이 포함된 PBS로 씻어낸 다음 1% bovine serum albumin(BSA), 5% sucrose, 0.05% NaN3를 함유한 PBS로 1시간 동안 차단하였다. 몇번을 씻어 낸 다음 동결 건조된 삼출액을 PBS로 녹인 다음, 표준곡선(standard curve)를 그리기 위하여 재조합한 cytokine을 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 배양하였다. Well을 씻어 낸 다음 avidine peroxidase를 첨가하고 37°C에서 20분동안 반응시켰다. Well을 다시 씻은 다음 ABTS(2, 2-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) tablets) 기질을 첨가하고, 발색 반응은 ELISA reader(EL 311, Bio-Tek Ins. Co. Vermont, USA)를 사용하여 405 nm에서 측정하였다.

결과 분석

   중이 저류액은 점도가 높기 때문에 농도 및 용량을 측정하기가 곤란하여 총단백량을 측정한 후, 세포활성물질 농도(pg/ml)를 총단백농도로 나누어 단위가 세포활성물질의 picogram/총단백의 milligram(pg/mg)이 되게 하여 분석하였다. MAST 검사에서 양성이었던 군을 알레르기 양성군으로 MAST 검사에서 음성이었던 군을 알레르기 음성군으로 하였다. 알레르기 양성군과 음성군을 Mann-Whitney U test를 사용하여 비교하였으며 p<0.05인 경우를 통계학적인 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

결     과


   재발성 만성 삼출성중이염 환자 130명 중 41명(31%)에서 1종 이상의 양성을 보였으며 혈중 IgE 농도는 증가되었다. 양성을 보인 41명에서 항원의 분포는 아메리카 집먼지진드기(D. pteronyssinus)와 유럽 집먼지진드기(D. farinae)가 각기 25(61%), 25(61%)로 가장 많았으며 다음이 집먼지순이었다. 양성을 보였던 환자들 41명 중 30명에서 알레르기비염, 아토피, 천식 병력을 가지고 있었다.
   ELISA를 사용하여 측정한 cytokine의 양성 반응률은 전체적으로 TNF-α가 59.7%(알레르기 양성군:60.5%, 음성군 58.9%), IL-2가 48.5%(알레르기 양성군:52.5% 음성군:54.5%), IL-4가 62.5%(알레르기 양성군:63.5 %, 음성군 61.5%), IL-6가 64.7%(알레르기 양성군:65.4%, 음성군 64.0%)였다(Fig. 1). 알레르기 양성군은 TNF-α는 알레르기 양성군이 2.86±0.13 pg/mg이었으며 알레르기 음성군은 1.99±0.19 pg/mg으로 알레르기 양성군에서 유의하게 높았다(p=0.019). IL-2는 알레르기 양성군이 3.95±2.35 pg/mg 이었으며 음성군이 3.90±1.75 pg/mg으로 알레르기 양성군이 높았으나 통계학적인 유의성은 없었다(p=0.061). IL-4는 양성군이 1.09±0.52 pg/mg이었으며 음성군은 0.34±0.04 pg/mg으로 양성군이 음성군에 비해 유의하게 높았다(p=0.007). IL-6는 양성군이 9.42±1.73 pg/mg이었으며 음성군은 8.24±2.57 pg/mg으로 양성군이 음성군에 비해 유의하게 높았다(p=0.041)(Fig. 2).

고     찰

   유소아 알레르기는 점차 증가 추세에 있으며 태생 직후부터 발생할 수 있으나 질환이 나타나는 부위나 양상은 나이에 따라 달라진다. 일반적으로 급성중이염 후 발생하는 삼출성 중이염은 생후 1년 이내에 발병하는 경우 재발할 가능성이 많다고 알려져 있다.8) 이러한 재발을 반복하는 만성 삼출성중이염에서 알레르기는 단독 감염과 함께 작용할 수 있다. 따라서 유소아의 알레르기 조기 진단은 중요하다. 유소아에서 알레르기 진단은 피부단자검사상 위음성이 자주 나타나며 따라서 Radioallergosorbent test(RAST)나 paper radioimmunosorbent test(PRIST)를 시행하는 것이 좋다. 저자들은 RAST는 동위원소를 취급해야하는 단점이 있어 신뢰도가 RAST와 비슷하여 최근 많이 사용되고 있는 MAST를 사용하였다.
   알레르기에서 주 역할을 하는 비반세포와 호염기구는 다양한 생물학적 매개물질(biological mediator)을 가지고 있다. 이중 histamine, 단백효소, proteoglycan 등은 세포내 과립에 기생성(preformed)되어 저장되어 있다. 또 어떤 것은 IgE나 항원 또는 다른 자극제에 의해서 세포가 활성화되면 생기게 된다. Cytokine은 비반세포나 호염기구에서 분비되는 매개물질 중 가장 최근에 알려진 것이다.9)
   Mossmann 등10)에 의하면 생쥐에서 T-helper 림프구를 그 세포로부터 분비되는 cytokine의 종류에 따라 IL-2, Interferron-gamma, Tumor necrotic factor-beta를 생산하는 Th1형 림프구와 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10을 생산하는 Th2형 림프구로 구분하였다. 이와같은 2분법이 엄격하게 적용되는 것은 아니지만 Th2 세포는 IgE를 만드는데 기여한다. 특히 IL-4와 IL-13은 B림프구에서 isotype switch를 유발하여 IgE 항체를 생산하도록 만들고 IL-4는 IL-13보다 2배 내지 5배 더 작용이 강하다. Interferon-gamma는 IL-4 및 IL-13의 이러한 작용을 억제시킨다.
   Maggi 등11)과 Robinson 등,12) Lee 등13)의 연구결과에 의하면 알레르기에서는 주로 Th2형 세포활성물질이 증가하는 것으로 알려져 있다. 본 연구의 결과는 이들의 연구 결과와 일치하였다.
   IL-2는 분자량 19kD의 당단백질로써 주로 활성화된 T-임파구에서 분비되어 cytotoxic T-cell, NK cell들과 대식세포를 활성화 시키고 다른 cytokine의 분비를 촉진 시킨다. Yeo 등3)에 의하면 IL-2와 IL-4가 장액성보다 점액성의 삼출액에 더 많이 포함되었다고 하였으며 이는 IL-2, IL-4는 삼출성 중이염의 초기보다는 오래 진행된 점액성의 중이염에서 염증반응의 진행에 중요한 역할을 수행하고 있다고 추정하였다. 본 연구 대상의 삼출액들은 대다수가 점액성이었기 때문에 장액성과 비교할 수 없었다. IL-2는 autocrine 기능이 있어 IL-2 수용체를 발현시키고 그 자체의 분비를 촉진시키는 등 세포활성의 첫 번째 지표이므로 IL-2의 발현은 B림프구 라인의 기능이 적절하여 항체생성이 제대로 될 것이라는 것을 예측할 수 있고, 이로써 그 숙주조직이 감염원에 대한 복원기능을 제대로 수행하리라 볼 수 있다. 즉 이는 특이적인 면역반응의 활성도에 관한 척도로 생각할 수 있다.
   IL-4는 분자량 15-20kD인 당단백질로써 Th-2세포와 비만세포에서 분비되며 신호체계는 확실하지 않지만 간접 경로를 통하여 phosphatidylinositol-3-kinase를 활성화시켜 protein kinase C를 전위시키므로 신호의 전달이 이루어진다. IL-4는 생물학적으로 B세포 성장을 자극하고 B세포에서 class Ⅱ의 주조직적합체의 표현을 유도하며 B세포 분화에서 IgE 및 IgG4의 표현에 필요한 switch factor로 작용한다. 또한 IL-4는 종양부위에 세포독성 호산구들의 급격한 침윤을 통해 항종양 활동력을 유발시킨다. IL-4는 비반세포에서 면역조직화학검사에서 발견되며 이 세포들은 IgE 항체에 의해 유발된 후에 IL-4와 histamine을 분비한다. Bradding 등14)에 의하면 알레르기 환자의 비점막내의 비반세포의 일부가 IL-4, IL-5, IL-6에 대한 면역활성을 지니고 있다고 한다.
   비반세포나 호염기구에서 나오는 IL-4는 T세포가 초기에 Th2 표현형으로 분화하는데 기여한다. 삼출성 중이염에서 IL-4 역시 IL-2처럼 T-cell이 관여하는 특이적 면역반응에 관여하며 염증반응 초기보다는 후기에 관여한다. Okamoto 등15)의 연구와 Park 등2)의 연구에서는 IL-4가 측정되지 않았다고 하여 본 연구 결과와는 상반되지만 보고자에 따른 차이는 이에대한 연구가 더 필요함을 시사한다.
   IL-6은 활성화 T세포, 대식세포, monocyte, 혈관내피세포, 섬유아세포들이 분비하는 26kD cytokine으로 IL-1 또는 TNF-α의 자극에 의해 생성되며, B세포의 분화에 관여하므로 세포 분화인자라 불리었다. IL-4에 비해 IL-6는 주로 Th2형에서 생산되지만 Th1형에서도 일부 생산된다. IL-6는 삼출성 중이염에서 역할은 아직 분명하지는 않지만 면역세포에서 특이적인 항체를 생산하여 중이강에서 세균이나 세균에서 유리된 물질을 제거하는데 관여한다고 추정할 수 있다. 그러나 단일 cytokine이라도 여러 종류의 세포에 의해 생산되고 각각의 표적세포에 다양한 효과를 나타내기 때문에 삼출성 중이염의 병인에 있어서 역할은 향후 지속적인 연구가 이루어져야 한다. 점액성 중이염은 장액성 중이염에 비해 점막하층에 임파구, 형질세포, 대식세포의 침윤이 풍부하며 immunoglobulin의 농도도 높아서 특이적 체액성 면역반응이 관여하리라 보고되었다.14) 알레르기가 삼출액의 점액성과 상호관련되는지 mucin gene의 연구를 통하여 향후 밝혀지리라 기대한다.
   본 연구 결과 IL-4, IL-6가 알레르기 양성군에서 음성군에 비해 유의하게 증가하고 IL-2는 별 차이를 보이지 않은것은 알레르기와 관련된 cytokine이 알레르기성 삼출성 중이염에서 활발하게 작용함을 제시한다. 현재 이에 대한 연구는 적기 때문에 보다 연구가 필요하며 주로 Th2형에서 생성되는 IL-10, IL-13들에 대한 측정도 향후 필요할것으로 사료된다.
   TNF-α는 활성화된 대식세포, 단핵세포, T세포, 중성구, NK세포에 의해 분비되는 세포활성물질로써 염증반응시 생성되는 다른 세포활성물질과 마찬가지로 면역반응동안 간세포에서 급격히 생산된다. 또한 TNF-α는 MHC class I, II, 다양한 세포활성물질, colony stimulating factor의 발현을 자극한다고 알려져 있다.16) TNF-α는 지다당(lipopolysaccharide)으로 처리한 동물의 혈청에서 종양괴사를 일으키는 인자가 발견되면서 확인되었다. TNF-α는 농도에 따라 다양한 생물학적 작용을 나타내며 IL-1의 생물학적 기능과 매우 유사하다. 소량 및 생리농도에서는 백혈구와 상피세포에 조절기능을 나타내어 효율적인 염증반응을 유발시키어 숙주를 보호한다. 또한 단핵식세포의 자극으로 IL-1, IL-6, IL-8 생산항진을 시킨다. TNF-α의 수용체는 거의 모든 세표표면에 표현되고 있다.
   일반적으로 오랜 이환기간을 가진 만성 삼출성 중이염군과 여러번 중이 환기관 유치술을 받은 경우에서 TNF-α는 증가한다고 알려져 있다. 또한 점액성에서 증가한다. 본 연구 대상들은 이환기간이 전례에서 오래된 재발성 만성 삼출성 중이염이었지만 알레르기 양성군은 음성군에 비해 유의하게 증가하였다. 본 연구 결과 TNF-α가 증가한것은 삼출성 중이염의 원인에서 알레르기 요인과 감염 요인이 복합적으로 작용함을 제시하며 상호 상승작용에 의해 TNF-α가 더 증가한것인지는 추후 연구가 더 필요하다.
   Gordon 등17)의 연구에 의하면 적절한 자극에 의해 생쥐의 비반세포로부터 TNF-α가 분비되는 것은 이러한 cytokine이 기생성되어 저장되어 있다가 즉시 분비됨을 보여 줄 뿐만 아니라 세포활성 후 수시간 동안 분비됨으로써 세포활성 후 수시간 동안 분비됨으로써 세포활성 후 TNF-α가 새로이 많은 양이 생성된다는 것을 나타내었다. 따라서 비반세포로부터 유도된 TNF-α는 IgE에 의한 이러한 세포의 활성 후 즉시 나타날 뿐만 아니라 오랫동안 지속적으로 나타날 수 있다. 호염기구도 비반세포와 마찬가지로 cytokine을 분비한다.
   비반세포와 백혈구, cytokine과의 관계는 비반세포의 활성화와 상호 관련되있다.
   따라서 중이 점막에 있는 비반세포의 TNF-α나 다른 cytokine들이 직접 혹은 간접적으로 중성구, 호산구, 호염기구, 림프구, 단핵구, 혈소판등과 같은 다른 추가적인 효과세포(effector cell)의 기능이나 침윤에 영향을 미친다. 침윤된 세포들은 비반세포에서 나오지 않는 TGF-α같은 새로운 cytokine을 분비함으로써 반응을 진행시킨다. 이들 cytokine이 혈관내피세포나 섬유아세포, 상피세포, 신경세포, 비반세포 등 세포에 복합적인 효과를 나타낸다. 따라서 이에 대한 연구는 더욱 이루어져야 할것으로 생각된다.
   저자들은 본 연구결과를 토대로 cytokine gene 연구와 mucin gene 연구를 실행할 예정이다. 본 연구는 기초자료로 사용될 것으로 사료된다.

결     론

   TNF-α와 Th2형 cytokine이 증가됨은 알레르기가 소아 재발성 삼출성 중이염에서 병인에서 중요한 역할을 하리라 사료된다. 이에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.


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