서     론

   두경부 편평세포암종은 모든 인체암의 5%를 차지하며, 두경부암의 90~95%를 이루는 악성종양으로 다양한 임상소견을 보인다.¹⁾ 두경부 종양의 치료 방법을 결정하기 위해서는 병기, 경부전이의 유무, 병리조직학적 분화도, 주위조직으로의 침윤정도 등 여러 가지 요인이 있지만 이들의 임상적용에는 한계점이 많고, 조기 진단과 치료의 발달에도 불구하고 5년 생존률은 아직 낮은 상태이다.
   특히 구강 및 구인두암에서는 초기암인 경우에 적절한 치료를 하였는데도 예상치 못한 나쁜 결과를 보이는 경우가 있다. 따라서 구강 및 구인두암의 경부전이, 재발 등을 예측하고 적극적인 치료에 도움을 주기 위하여 암의 발생과 진행에 관여하는 유전자의 변화를 치료방침 결정에 이용하려는 노력이 많이 시도되어 왔다.
   Microsatellite는 게놈 전반에 걸쳐 풍부하게 존재하는 짧은 반복 DNA로 단백질 합성에 직접 관여하는 유전자 부호 기능을 하지 않는 DNA로 알려져 왔지만, 부모로 부터 자손에게 안정되게 유전되며, 대립 유전자 형질의 다양성 때문에 주로 유전자 감식에 사용되었다. 반복 부분의 형태가 (CA)n이나 (GT)n 같이 dinucleotide로 존재하는 경우 이형 유전자가 많으므로 염색체 결손검사에 특히 유용하다. Microsatellite를 이용하여 염색체상 이형접합성 상실(loss of heterozygosity, 이하 LOH)을 관찰함으로써 상실부위에 존재하는 종양억제유전자의 불활성화를 간접적으로 추정할 수 있다. 이런 연구는 여러 고형 종양에서 종양억제유전자의 위치 확인과 클로닝(cloning) 과정을 연구하는데 결정적인 방법론으로 이용되고 있다.²⁾
   본 연구에서는 구강 및 구인두 편평세포암종에서 일어나는 염색체 결손 빈도를 알아보고 각각의 변화가 악성 표현형에 미치는 영향을 분석하기 위해서 microsatellite 표지자를 이용하는 중합효소연쇄반응법(PCR)으로 3번, 9번, 17번 염색체 결손을 조사하였다. 구강 및 구인두 편평세포암종 환자에서 채취한 종양 조직의 파라핀 포매조직에서 종양 세포들만을 Lee 등³⁾이 개발한 미세 절제 장비와 기술을 사용하여 선택적으로 채취하였다. 이 세포들에서 두경부 편평세포암종의 발생 및 진행에 관련이 있다고 여겨지는 p53, p16^INK4a, FHIT(fragile histidine triad) 유전자 주위의 microsatellite marker에 대한 LOH를 관찰하고, 구강 및 구인두 편평세포암종의 임상적 특징에 대한 후향적 고찰을 시행함으로써 이들을 예후 인자로 적용할 수 있는지 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

실험 재료

   실험 재료는 가톨릭대학교 의과대학 강남성모병원 이비인후과에서 구강 및 구인두의 편평세포암종으로 확진받아 수술한 25명에서 채취된 절제조직을(설암 18명, 편도암 5 명, 후인두벽암 2명) 대상으로 하였다. 환자의 평균연령은 56.6세이고 남자는 16명, 여자가 9명이었고 평균 추적 관찰기간은 21.5개월이었다. 환자의 병기는 AJCC(American Joint Committee on Cancer, 1997)의 분류법을 따랐다.

실험 방법

종양세포의 DNA 추출을 위한 Microdissection
   종양조직의 DNA만을 추출하기 위하여 Lee 등³⁾에 의한 microdissection technique을 이용하였다. 종양조직은 파라핀 포매조직에서 절편을 얻어 탈 파라핀 및 헤마톡실린 에오신 염색을 한 후, 2% glycerol buffer에 약 2분간 두었다가 micromanipulator(부광, 서울)에 부착된 30 gauge needle로 microdissection하여 20 μl의 DNA 추출 용액(0.5% Tween 20, 1 mM EDTA, PH 8.0, 50 mM Tris-Hcl PH 8.5)에 넣었다.

DNA 분리
   DNA 추출은 single step DNA extraction method⁴⁾를 이용하여 proteinase K(2 mg/ml)을 가하고 50°C에서 2일간 두었다가 95°C에서 10분간 두어 proteinase K 활성을 파괴하고 4°C에서 보관하여 PCR template로 사용하였다. 대조군으로 정상조직의 DNA는 같은 방법으로 추출하여 얻었다.

이형접합성 상실의 분석
   PCR은 template DNA(100 mg/μl) 1 μl, 10×PCR buffer(＋MgCl₂) 2 μl, dNTP(2.5 mM) 2 μl, 증류수 13.7 μl, 감지시발체(sense primer, 20 pM), 항감지시발체(anti-sense primer, 20 pM) 각각 0.6 μl, Taq polymerase(5 U/μl) 0.1 μl를 0.5 ml tube에 넣어 잘 섞고 총 20 μl의 양이 되도록 한후 mineral oil을 한 방울 떨어뜨린 후 PCR을 시행하였다. PCR은 DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer, CA, USA)를 사용하였다. PCR 조건은 첫 단계로 95°C에서 2분간 DNA를 변성 시킨 후, 두 번째 단계에서는 94°C에서 45초간 denaturing, annealing 1분, 72°C에서 1분간 extension의 반응을 32회 반복하여 증폭시키고, 72 °C에서 5분간 연장반응을 시행하고, 4°C에서 정지하였다. Annealing 온도는 TP53은 62°C, D3S1067은 57°C, D9S 165는 55°C에서 시행하였으며, 사용한 marker(Research Genetics, Huntsvilli, AL, USA)의 시발체 염기서열 및 크기는 Table 1과 같다.
   증폭된 유전자는 1차적으로 1% 한천 젤(agarose gel)에서 전기 영동상을 관찰하여 유전자 증폭산물을 확인한 후 PCR산물 15 μl와 loading buffer 10 μl(95% formamide, 20 mM EDTA, 0.05% bromophenol blue and 0.05 % xylene cyanol)와 혼합하고 95°C에서 5분간 변성시킨 뒤 얼음이 들어있는 수조에서 급냉시켜 8 M urea를 포함한 6% denaturing polyacrylamide gel에서 2,000 volt로 1~2시간 전기영동한 후 은염색을 시행하여 관찰하였다. 은염색은 고정액(10% glical acetic acid)에 30분간 DNA를 고정시키고 3차 증류수로 3회 세척한 후 은염색(Silver nitrate, SilverstarTM Staining System, Bioneer corp. Chungwon, Korea)을 30분간 시행하고 발색용액에 넣어 DNA 띠가 보일 때까지 흔들어주고 띠가 보이면 정지 용액으로 2분간 처리하여 실온에서 건조시킨 후 관찰 판독하였다. 대립형질의 소실은 정상 대립형질에 비하여 DNA의 한쪽 대립형질이 소실된 경우(50%이하)를 LOH로 판단하였다.

자료의 분석과 통계처리

   자료의 유의성 검정에서, 이형접합성 상실과 임상병리학적 인자와의 분석에는 SAS(Strategic Application System, release 6.12)를 사용하여 chi-square검정을 시행하였고, 표본수가 적은 경우에는 Fisher's exact test로 하였다. 유의성 검정에서 유의수준은 p<0.05 범위로 정하였다.

결     과

   25예의 구강 및 구인두 편평세포암종에서 염색체 3번, 9번, 17번의 이형접합성 상실을 관찰하였다. Microsatellite 표지자를 이용하여 PCR 후에 전체적으로 관찰하였을 때, 한 염색체 또는 두 염색체 이상에서 LOH를 보이는 경우는 11예이었고, LOH가 보이지 않는 경우는 14예이었다.

3p의 D3S1067를 이용한 이형접합성의 빈도

   FHIT 유전자의 marker인 D3S1067의 경우 25예 중 판독이 가능한(informative) 경우는 15예 이었고, 이 중 4예(27%)에서 LOH가 발견되었고, 95 bp의 띠에서 LOH를 관찰할 수 있었다.

9p의 D9S165를 이용한 이형접합성의 빈도

   p16^INK4a의 유전자와 가까이 위치하고 있는 marker인 D9S165의 경우 25예 중 판독이 가능한(informative) 경우는 13예 이었고, 이 중 4예(31%)에서 LOH가 발견되었고, 202-226 bp의 띠에서 LOH를 관찰할 수 있었다.

17p의 TP53을 이용한 이형접합성의 빈도
   p53 유전자에 대한 marker인 TP53은 25예 중 판독이 가능한(informative) 경우는 17예 이었고, 이 중 6예(35%)에서 LOH가 발견되었으며, 103~135 bp의 띠에서 LOH를 관찰할 수 있었다(Table 1, Figs. 1 and 2, Table 2).

임상병리학적 특징과의 상관 관계

   임상병리학적 특징과 LOH와의 상관 관계를 관찰하기 위하여, 3개의 marker중 LOH가 한 개 이상 보이는 11명을 A군으로 하고, LOH가 보이지 않는 14명을 B군으로 나누었다. A군과 B군의 재발율은 각각 83%, 32%로 A군에서 높게 나타났으며(p＝0.056), A군과 B군의 분화도는 각각 60%, 20%에서 나쁜 분화도를 보여, A군에서 더 높게 나타났으나(p＝0.099), 유의수준 p<0.05으로 판정하여 볼 때 통계적 유의성은 없었고, 구강 및 구인두 편평세포암종의 병기나 주위조직으로의 침윤정도, 나이, 경부 림프절 전이의 유무에 따른 A군과 B군의 통계적인 유의한 차이가 없었다(Table 3).

고     찰

   최근 종양에 대한 분자생물학적 연구가 활발히 진행되어 암은 유전자 질환으로 밝혀지고 있다. 암 발생은 다단계적 다발성 유전자 변화가 체세포에 단계적으로 축적되어 세포의 성장 조절능력이 상실되어 일어나는 것으로 알려져 있으며,⁵⁾ 암유전자 활성화(oncogene activation), 유전자의 전위(gene translocation), 종양억제유전자 비활성화(tumor suppressor gene inactivation)등의 기전이 규명되어 있다. 이 중 종양억제유전자의 비활성화는 정상세포에서 암이 발생하는 생성 기전 중에 가장 많이 알려진 유전학적 변이로서, 종양억제유전자의 비활성화를 확인하는 방법중 암세포에서 이형접합성 상실에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다.
   두경부 편평세포암종에서 이형접합성 상실은 3p, 8p, 9p, 10q, 11p, 13q, 17p, 18p에서 보고되었고, 이 중 가장 빈번하게 나타난다고 알려진 부위는 3p, 9p21, 17p13 이다.⁶⁾⁷⁾ 3p 이형접합성 상실은 폐암과 가장 관련이 많은 것으로 알려져 있고, 3p 염색체는 최소 3개 이상의 부위에 종양억제유전자가 위치하는 것으로 알려져 있으며,⁸⁾ 이 중 두경부 편평세포암종과 관련이 있다고 알려진 Fargile Histidine Triad(FHIT) 유전자의 marker인 D3S1067을 선택하였다.⁹⁾ 9p 염색체는 cyclin dependent kinase inhibitor인 p16의 유전자 부호를 가진 p16^INK4a 유전자(9p21)를 포함하며,¹⁰⁾ p16 ^INK4a 유전자는 IFNA와 D9S171사이에 위치하고 있고, 9p21의 이형접합성 상실은 방광암이나 악성 흑색종, 폐암, 뇌종양 등 다른 고형종양에서 많이 보고되었으며, 9p21 부위에서 흔히 변이가 있는 marker로서 p16 ^INK4a 유전자에 인접하여 있는 D9S165를 선택하였다. 17p13.1부위는 p53 유전자가 위치하는 것으로 알려져 있으며,¹¹⁾ 17p13.1 부위의 이형접합성 상실은 유방암, 대장암 등 많은 다른 암에서 보고되고 있으며,¹²⁾ 이 유전자의 marker인 TP53을 선택하였다.
   실험 결과 D3S1067의 이형접합성 상실의 빈도는 27%(4/15), D9S165의 이형접합성 상실의 빈도는 31%(4/13), TP53의 이형접합성 상실의 빈도는 35%(6/17)로 각각 관찰되었다. 이전의 다른 연구 결과를 보면, 3p의 이형접합성 상실의 빈도는 27~81%,^8)13)14) 9p의 이형접합성 상실의 빈도는 45~72%,¹⁵⁾¹⁶⁾ 17p의 이형접합성 상실의 빈도는 45~50%^7)12)17)로 본 연구 결과보다 이형접합성 상실의 빈도가 약간 높게 보고되고 있으나 이는 본 연구에서 시행한 marker가 3p, 9p, 17p에서 각각 하나인 점을 고려한다면, 비슷한 결과라고 할 수 있다. 또한 통계적으로 유의한 이형접합성 상실의 빈도를 20% 이상으로 생각할 때,⁷⁾ 3개의 marker에서 모두 20%를 넘게 나타났으며, 두경부 편평세포암종에서 3p, 9p, 17p에서 가장 높은 이형접합성 상실이 관찰된다는 이전의 연구 결과와도 일치하였다.^6)15)18)
   이형접합성 상실의 분석을 시행할 때 암세포의 비율이 낮은 경우 이형접합성 상실의 검출 가능성이 떨어지므로 종양조직에서 암세포를 순수하게 분리하는 것이 필수적이다. 이에 저자는 파라핀 포매 조직에서 Lee 등³⁾이 고안한 새로운 미세 절제술을 사용하여 암세포만을 선택적으로 분리하여 실험의 오류를 줄이려고 노력하였다.
   이형접합성 상실과 두경부 종양의 예후와의 관계는 진행된 후기 단계의 경우에 이형접합성 상실의 빈도가 높아, 두경부 종양의 예후 인자와의 관련성이 보고되고 있고,^7)19)20) 본 연구에서도 이형접합성 상실의 유무에 따라 A, B군으로 나누어서 두경부 종양의 예후에 중요한 재발율을 비교한 결과 각각 83%, 32%로 A군에서 높게 나타났으며(p＝0.056, Fisher's exact, 2-tailed), A군과 B군의 분화도는 각각 60%, 20%에서 나쁜 분화도를 보여, A군에서 더 높게 나타났으나(p＝0.099, Fisher's exact, 2-tailed), 유의수준 p<0.05으로 판정하여 볼 때 통계적 유의성은 없었다. 그러나 증례의 수가 적은 것을 고려하여 볼 때, 이형접합성 상실은 구강 및 구인두 편평세포암종의 예후인자로 적용될 가능성이 있다고 생각된다.

결     론

   구강 및 구인두 편평세포암종에서 microsatellite의 이형접합성 상실의 빈도는 외국의 두경부 편평세포암종의 이형접합성 상실의 빈도와 유사하게 조사되었으며, 한국인의 구강 및 구인두 편평세포암종에서의 이형접합성 상실의 유무와, 임상 병리학적 인자와의 연관성이 있는 지를 좀 더 명확히 규명하기 위해서는 향후 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

1. Jacobs C, Goffinet DR, Fee WE. Head and neck squamous cancers. Current Problems in Cancer. Chicago, Year Book Medical Publishers, Inc, 1990;Jan/Feb p.14.

2. Marshall CJ. Tumor suppressor genes. Cell 1991;64:313-26.

3. Lee JY, Dong SM, Kim SY, Yoo NJ, Lee SH, Park, WS. A simple, precise and economical microdissection technique for analysis of genomic DNA from archival tissue section. virchows Arch 1998;433:305-9.

4. Turbett GR, Barnett TC, Dillon EK, Sellner LN. Single tube protocol for the extraction of DNA or RNA from paraffin-embedded tissue using a starch based adhesive. Biotechniques 1996;20:846-53.

5. Weinberg RA. Oncogenes, anti-oncogenes, and the molecular bases of multistep carcinogenesis. Cancer Res 1989;49:3713-21.

6. Ah-See KW, Cooke TG, Pickford IR, soutar D, Balmain A. An alleo-type of squamous carcinoma of the head and neck using microsatellite markers. Cancer Res 1994;54:1617-21.

7. Li X, Lee NK, Ye YW, Waber PG, Schweizer C, Cheng QC, et al. Allelic loss at chromosomes 3p, 8p, 13q, and 17p associated with poor prognosis in head and neck cancer. J Natl Cancer Inst 1994;86:1524-9.

8. Maestro R, Gasparotto D, Vukosavljevic T, Barzan L, Sulfaro S, Boiocchi M. Three discrete regions of deletion at 3p in head and neck cancers. Cancer Res 1993;53:5775-9.

9. Mao L, Fan YH, Lotan R, Hong WK. Frequent abnormalities of FHIT, a candidate tumor suppressor gene, in head and neck cancer cell lines. Cancer Res 1996;56:5128-31.

10. Nobori T, Miura K, Wu DJ, Lois A, Taka bayashi K, Carson Da. Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers. Nature 1994;368:753-6.

11. Soder A, Hopman AH, Ramaekers FC, Conradt C, Bosch FX. distinct nonrandom patterns of chromosomal aberrations in the progression of squamous cell carcinomas of the head and neck. Cancer Res 1995;55:5030-7.

12. Nagai MA, Miracca EC, Yamamoto L, Moura RP, Simpson AJ, Kowalski LP, et al. TP53 genetic alterations in head-and-neck carcinomas from Brazil. Int J Cancer 1998;76:13-8.

13. Ransom DT, Leonard JH, Kearsley JH, Turbett GR, Heel K, Sosars V, et al. Loss of heterozygosity studies in squamous cell carcinomas of the head and neck. Head Neck 1996;18:248-53.

14. Gonzalez MV, Pello MF, Ablanedo P, Suarez C, Alvarez V, Coto E. Chromosome 3p loss of heterozygosity and mutation analysis of the FHIT and β-cat genes in squamous cell carcinoma of the head and neck. J Clin Pathol 1998;51:520-4.

15. Nawroz H, van der Reit P, Hruban RH, Koch W, Ruppert M, Sidransky D. Allelotype of head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res 1994;54:1152-5.

16. Lydiatt WM, Davidson DJ, Shah J, Schantz SP, Chaganti RS. The relationship of loss of heterozygosity to tobacco exposure and early recurrence in head and neck squamous cell carcinoma. Am J Surg 1994;168:437-40.

17. Adamson R, Jones AS, Field JK. Loss of heterozygosity studies on chromosome 17 in head and neck cancer using microsatellite markers. Oncogene 1994;9:2077-82.

18. Field JK, Kiaris H, Risk JM, Tsiriyotis C, Adamson R, Zoumpourlis V, et al. Allelotype of squamous cell carcinoma of the head and neck: fractional allele loss correlates with survival. Br J Cancer 1995:72:1180-8.

19. Partridge M, Emilion G, Langdon JD. LOH at 3p correlates with a poor survival in oral squamous cell carcinoma. Br J Cancer 1996;73:366-71.

20. Lydiatt WM, Davidson DJ, Schantz SP, Caruana S, Chaganti RS. 9p21 deletion correlates with recurrence in head and neck cancer. Head Neck 1998;20:113-8.