서     론

   알레르기성 비염은 호산구 침윤과 기저막 비후와 같은 비점막의 구조 변화를 특징으로 하며, 이러한 염증변화는 제1형 면역반응에 의한 것으로 여러 종류의 매개물질이 관여한다. 알레르기성 비염 환자의 비점막에서는 교원질(collagen)이 침착하여 기저막의 망상층(reticular layer)이 두꺼워진다.¹⁾
   Matrix metalloproteinase(기질단백분해효소, MMP로 약함)는 아연과 칼슘­의존 엔도펩티다아제(endopeptidase)의 일종으로 MMP-1, MMP-2(gelatinase A), MMP-3, 및 MMP-9(gelatinase B) 등으로 구분되며 결체 조직들의 여러 구성성분을 분해한다.²⁾³⁾ 특히 MMP-9은 기저막의 주요성분인 젤리틴(gelatin)과 교원질을 분해하며 염증반응시 MMP의 작용에 의해 염증세포들의 이동과 침윤이 촉진된다.⁴⁾ 조직발달과 재형성과정에서 이러한 MMP뿐만 아니라 MMP의 조직억제제(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP로 약함)도 동시에 분비된다. TIMP는 생체내에서 MMP의 작용을 억제하는 기능을 가지고 있고, 4종류의 TIMP가 보고되고 있다. 이 중 TIMP-1은 gelatinase B 전효소(proenzyme)에 결합하여 MMP-9의 작용을 억제하고, TIMP-2는 잠재형 gelatinase에 결합하여 MMP-2의 작용을 억제한다.⁵⁾⁶⁾
   염증반응, 조직재형성, 상처 재생과정에서 MMP유전자의 발현은 사이토카인, 성장 인자, 염증 매개체, 호르몬 등 여러 요소들에 의해 조절된다.⁷⁾ MMP-9/TIMP-1의 균형에 이상이 생기면 류마트스양 관절염, 골관절염, 여러 폐질환, 신장질환, 섬유화 및 종양의 침습 등의 여러 병적 과정이 유발된다.^8-11) 그러나 염증성 비점막의 재형성 기전은 잘 알려져 있지 않고, 알레르기성 비염의 병리생태에 있어서 MMP-9과 TIMP-1의 상호 작용에 관한 연구는 미흡하다. 따라서 알레르기성 비염환자와 정상 대조군의 비점막에서 면역조직화학적 검사를 이용하여 MMP-9과 TIMP-1의 발현양상을 비교하고, 침윤된 호산구와 MMP-9의 발현과의 상관관계를 관찰하였다.

대상 및 방법

대  상

   알레르기 코증상이 있으면서, 비즙 도말검사, 피부 단자검사, 혈액중 호산구검사 및 RAST 등의 알레르기 검사에서 집먼지 진드기(D.p., D.f.)에 양성을 보이고 최소한 1개월 이상 약물투여를 받지 않은 알레르기성 비염환자 20예(남：8예, 여：12예, 평균연령：32세)를 연구 대상으로 하였다. 대조군은 비내 염증 질환이 없고 외비성형술을 시행한 환자에서 채취한 정상 하비갑개 점막 20예(남：14예, 여：6예, 평균연령：29세)를 사용하였으며 상기의 알레르기 검사상 음성반응을 보였다.

검체의 채취 및 처리

   국소 마취하에 하비갑개 전단으로 부터 1 cm 뒤에서 비점막을 겸자를 이용하여 채취한 후 10% formaldehyde 용액(pH 7.6)으로 고정한 후 파라핀으로 포매하여 4 μm두께의 절편을 만들었다.

면역조직화학적 염색 및 관찰

   면역 염색은 universal LSAB kit(DAKO, Copenhagen, Denmark)를 이용하여 avidin-biotin peroxidase comlpex(ABC) 법으로 하였다. 파라핀 조직 슬라이드를 탈파라핀시킨 후 내인성 페록시다아제 활성을 억제시키기 위하여 0.3% H₂O₂로 15분간 처리하고 인산완충용액(pH 7.6)으로 세척하였다. 비특이적 항원 항체반응을 억제하기 위하여 30분간 정상 소혈청으로 처리한 후 단클론성 항체 MMP-9(Calbiochem, La Jolla, CA)과 TIMP-1(Calbiochem, La Jolla, CA)로 4°C에서 24시간 동안 처리하였다. 이차항체로 biotinylated anti-mouse를 사용하여 30분간 반응시켰다. 인산완충용액으로 세척 후 avidin conjugated horse-radish peroxidase에 30분, diaminobenzidine(Sigma, St. Louis, MO)으로 5분간 반응시켜 발색시켰다. 대조염색은 Meyer's hematoxylin으로 1분간 반응시켰고, 음성 대조군은 위 과정 중 일차항체 대신 인산완충용액을 사용하였다.

MMP-9과 TIMP-1의 면역염색 면적 측정

   면역염색된 슬라이드를 400배 광학 현미경으로 관찰하여 NIH image program(National Technical Information Service, Springfield, VA)을 이용하여 전체 면적에 대한 MMP-9 혹은 TIMP-1으로 면역염색된 면적(percentage of immunostained area)의 비율을 측정하였다.

호산구 염색 및 관찰

   Chromotrope 2R(Sigma, St.Louis, MO)로 호산구를 염색하여 고배율(400배)의 광학현미경하에서 염색된 호산구수를 계산하였으며 연속된 10개 시야에서 관찰하여 평균을 구하였다.

통계학적 분석

   모든 자료는 Macintosh용 통계프로그램인 StatView(Abacus Concepts Inc., Berkeley, CA)를 이용하여 mean±SE로 나타내고, 각 군간의 비교는 student t test로 시행하였다. MMP-9에 면역염색된 면적과 호산구수 간의 상관관계는 Spearman 상관계수를 이용하였으며, p<0.05를 통계적 의미로 두었다.

결     과

MMP-9과 TIMP-1 발현
   MMP-9은 정상 대조군에서는 상피세포(주로 기저층), 세포외 기질과 점막하 분비선에서 발현되었다(Fig. 1A and C). 알레르기성 비염 환자군에서는 상피세포(전층), 세포외 기질, 점막하 분비선(Fig. 1B and D)과 침윤된 염증세포(Fig. 2A)에서 발현되었다.
   TIMP-1은 정상 대조군에서는 상피세포(주로 기저층), 세포외 기질과 점막하 분비선에서 발현되었다(Fig. 2A and C). 알레르기성 비염 환자군에서는 상피세포(전층), 세포외 기질, 점막하 분비선(Fig. 3B and D)과 침윤된 염증세포(Fig. 2B)에서 발현되었다.

MMP-9과 TIMP-1의 면역염색 비율

   비점막 상피층과 점막하 세포외 기질에서의 MMP-9과 TIMP-1의 면역염색 면적은 대조군에 비해 알레르기성 비염 환자군에서 유의하게 많았다(p<0.01). 또한 MMP-9의 면역염색 면적은 TIMP-1보다 유의하게 많았다(Figs. 4 and 5)(p<0.05).

침윤된 호산구수와 MMP-9 면역양성 염색 면적

   비점막에 침윤된 호산구수가 증가할수록 MMP-9 면역염색 면적은 유의하게 증가하였다(γ＝0.78, p<0.01)(Fig. 6).

고     찰

   알레르기성 비염 환자의 비점막에서 MMP-9과 TIMP-1에 대한 면역조직화학적 염색을 시행한 결과 면역 양성세포는 상피세포, 침윤된 염증세포, 세포외 기질과 점막하 분비선에서 발현되었으며, MMP-9과 TIMP-1의 면역염색 면적은 대조군에 비해 알레르기성 비염 환자군에서 유의하게 많았고, 침윤된 호산구수와 MMP-9 면역염색 면적과는 유의한 상관관계가 있음을 보여주었다.
   세포외 기질(extracellular matrix)은 조직의 항상성과 종양 침윤, 상처 치유, 염증성 질환 및 섬유형성 질환과 같은 병적 상태에 관여하며 MMP는 이러한 세포외 기질 성분을 분해한다. 교원질은 비점막 조직에서 세포외 기질의 중요한 요소로 조직의 구조적 골격을 이루고 상처나 염증반응 후에 조직의 재형성 과정에 중요하다.⁸⁾ Roche¹²⁾는 천식 환자에서 기관지 상피 밑에서 과도한 간질성 교원질(interstitial collagen) 침착은 조직의 재형성 과정에 중요하고, 호산구에 의한 상피 파괴는 기도 과민증의 연쇄반응을 유발시키며, 기저막의 비후는 상피세포에 대한 지속적인 손상의 결과라고 하였다. Sanai 등¹⁾은 알레르기성 비염환자와 대조군의 비점막에서 교원질의 총량은 양군 사이에 차이가 없지만, 알레르기 비염군에서 교원질은 주로 상피하 기저막(subepithelial basement membrane)에 침착되어 기저막이 두꺼워진다고 하였으며 이러한 결과로 알레르기성 비염에서 비점막의 재형성은 주로 기저막에서 발현된다고 하였다.
   MMP-9은 섬유아세포를 포함한 결체조직, 내피세포, 상피세포, 호산구와 대식세포 등의 여러 염증세포에서 분비된다.³⁾⁸⁾ Dahlen 등¹³⁾은 MMP-9이 기저막에서도 발현된다고 하였다. 본 실험에서도 MMP-9은 상피세포, 세포외 기질, 침윤된 염증세포 및 점막하 분비선에서 관찰되었으며, MMP-9의 억제제인 TIMP-1 발현도 MMP-9발현과 같은 세포에서 관찰되었다. 그러나 본 연구에서는 침윤 염증세포에서 면역 양성을 보이나 이중염색을 시행하지 않아 MMP-9과 TIMP-1의 정확한 세포 기원을 밝히지 못하였다. 혈액에서 순환하는 호산구와 정상 기관지 점막의 호산구는 MMP-9을 발현하지 않지만, 천식 환자의 기관지 점막의 염증에서 활성화된 호산구는 MMP-9을 분비하고, 정상 대조군에 비하여 MMP-9 mRNA의 발현이 증가되어 있다.¹⁴⁾¹⁵⁾ 또한 MMP-9은 염증세포의 침윤과 관련 있고 기관지 천식의 병태인 기도과민반응과 관련 있다. Mautino 등7)은 정상 대조군에 비하여 천식환자의 기관지폐포성 세척으로 부터 얻은 용액을 원심분리하여 얻은 상청액에서 MMP-9의 증가를 보고하였다. 본 실험에서는 비점막에 침윤된 호산구수와 MMP-9 발현사이에 유의한 상관관계가 있었으며(p<0.01), 이는 MMP-9가 호산구와 같은 염증세포에서 분비되기 때문으로 생각된다. 내피세포와 상피 기저막의 주요 성분의 하나인 IV 형 콜라겐은 알레르기성 비염에서 증가된 호산구에서 분비된 MMP-9에 의하여 쉽게 파괴되어 혈관투과성을 증가시켜 기도의 부종을 일으키며, 기저막을 통하여 염증세포의 이동을 촉진하여 비점막 과민증을 증가시킬수 있다.¹⁶⁾
   MMP의 유전자 발현은 여러 사이토카인과 성장인자에 의하여 조절된다. IL-1, TNF-α, TGF-β, 상피성장인자, 섬유아세포성장인자, 및 혈소판 유래성장인자 등은 MMP-9 mRNA의 전사(transcription)를 증가시키지만, TGF-β와 IL-4 등은 전사를 감소시킨다.¹⁷⁾ 알레르기성 비염 환자의 염증 반응에는 IL-3, IL-5, GM-CSF, TNF-α,와 IL-1β 등이 존재하고, 비점막 조직의 호산구는 EG2^＋을 보여 활성화되어 있기 때문에 알레르기성 비염에서 호산구가 MMP-9의 합성을 촉진 시킬 수 있다.¹⁸⁾
   MMP-9과 TIMP-1의 발현량은 image analyzer program을 이용하여 반정량적이며 객관적으로 면역염색 면적으로 구하였다. 상피층과 점막하층 모두에서 MMP-9과 TIMP-1 면역염색 면적은 대조군에 비하여 알레르기성 비염 환자군에서 유의하게 높았고, 알레르기성 비염 환자군의 점막하층에서 MMP-9의 면역염색 면적은 TIMP-1의 면역염색 면적보다 유의하게 많았다(p<0.05).
   정상인에서 MMP-9은 여러 세포에서 비활성 전효소(proenzyme)로서 잠재형으로 분비되고 여러 생리적인 조건하에서 propeptide 를 소실하여 활성화되며 기질(세포간질)에서 교체(turnover)가 일어난다.¹⁹⁾ 또한 TIMP는 MMP-9과 1：1로 비공유적으로 결합으로 MMP-9의 효소 작용을 억제한다. 조직 재생 과정에서 MMP와 억제제의 적당한 균형은 조직 치유에 중요하다. Bullene 등²⁰⁾에 의하면 TIMP-1은 수술후 48시간에 상처액에서 유의하게 증가하고, 상처 치유에서 gelatinase 활동에 대한 TIMP-1의 비율은 시간에 따라 감소하지만 만성적인 상처에서는 높은 비율로 남아있다. MMP-9과 TIMP-1 사이의 동적인 균형은 조직의 통합성(integrity)을 유지하는데 중요하며⁸⁾ MMP와 TIMP의 불균형은 다른 여러 병적 질환에서 관찰된다. 골관절염(osteoarthritis)과 낭성섬유증(cystic fibrosis)과 같은 여러 가지 병적 상태에 있어서 증가된 TIMP농도는 상대적으로 더 많이 증가된 MMP의 농도를 보상하지 못하여 조직의 분해가 일어난다.⁸⁾⁹⁾ 류마티스양 관절염에서 혈청 MMP-9 수치는 증가되어 있고 따라서 관절 조직을 퇴행시키는 지속적이고 강한 염증 반응을 일으킨다. 조직내 MMP와 TIMP의 생물학적 활성 사이의 균형은 재형성 과정에 중요하게 작용하고 MMP：TIMP 비율은 이러한 질환에서 예후 인자로 작용한다. 따라서 과도한 MMP 분비는 조직의 구조적인 퇴행을 일으키고, 반면에 과도한 TIMP는 조직 재생과정과 섬유화를 촉진한다.
   알레르기성 비염은 비점막에 림프구와 호산구가 침윤을 특징으로 하는 비점막의 염증성 질환이다. 이러한 염증 과정은 비점막의 섬유아세포를 활성화시켜 비점막의 재형성을 유발한다. 비점막의 부적절한 재생 과정은 만성 염증에 의한 조직 파괴를 일으키며 이러한 비점막의 구조 변화는 알레르기성 비염의 병인에 중요한 역할을 한다.
   알레르기성 비염에서 MMP-9의 면역염색 면적은 TIMP-1 면적보다 넓게 발현되어 이것이 비점막 조직의 균형을 파괴하고 비점막에서 여러 병적 과정을 유발하는 것으로 생각된다. 그러므로 알레르기성 비염에서 기저막의 비후(두꺼워짐)를 예방하기 위하여 MMP-9과 TIMP-1 사이의 균형을 유지하는 기전에 대한 연구가 필요할 것으로 생각되며, 이러한 두 가지 효소의 작용 기전과 역할을 이해하는 것은 알레르기성 비염에서 일어나는 비점막의 만성 변화에 대한 치료에 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.

결     론

   알레르기성 비염환자의 비점막에서 MMP-9과 TIMP-1의 불균형은 기저막 비후 등의 비점막 재형성(remodeling)을 일으키는 한 요소로 작용할 것으로 생각된다.

1. Sanai A, Nagata H, Konno A. Extensive interstitial collagen deposition on the basement membrane zone in allergic nasal mucosa. Acta Otolaryngol 1999;119:473-8.

2. Delacourt C, Le Bourgeois M, D'Ortho MP, Doit C, Scheinmann P, Navarro J, et al. Imbalance between 95 kDa type IV collagenase and tissue inhibitor of metalloproteinases in sputum of patients with cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 1995;152:765-74.

3. Hoshino M, Nakamura Y, Sim J, Shimojo J, Isogai S. Bronchial subepithelial fibrosis and expression of matrix metalloproteinase-9 in asthmatic airway inflammation. J Allergy Clin Immunol 1998;102:783-8.

4. Nakagawa T, Kubota T, Kabuto M, Sato K, Kawano H, Hayakawa T, et al. Production of matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 by human brain tumors. J Neurosurg 1994;81:69-77.

5. Herbst H, Wege T, Milani S, Pellegrini G, Orzechowski HD, Bechstein WO, et al. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and -2 RNA expression in rat and human liver fibrosis. Am J Pathol 1997;150:1647-59.

6. Murphy G, Docherty AJ. The matrix metalloproteinases and their inhibitors. Am J Respir Cell Mol Biol 1992;7:120-5.

7. Mautino G, Oliver N, Chanez P, Bousquet J, Capony F. Increased release of matrix metalloproteinase-9 in bronchoalveolar lavage fluid and by alveolar macrophages of asthmatics. Am J Respir Cell Mol Biol 1997;17:583-91.

8. O'Connor CM, FitzGerald MX. Matrix metalloproteases and lung disease. Thorax 1994;49:602-9.

9. Bosse M, Chakir J, Rouabhia M, Boulet LP, Audette M, Laviolette M. Serum matrix metalloproteinase-9: Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 ratio correlates with steroid responsiveness in moderate to severe asthma. Am J Respir Crit Care Med 1999;159:596-602.

10. Gruber BL, Sorbi D, French DL, Marchese MJ, Nuovo GJ, Kew RR, et al. Markedly elevated serum MMP-9 (gelatinase B) levels in rheumatoid arthritis: A potentially useful laboratory marker. Clin Immunol Immunopathol 1996;78:161-71.

11. Kikuchi K, Kubo M, Sato S, Fujimoto M, Tamaki K. Serum tissue inhibitor of metalloproteinases in patients with systemic sclerosis. J Am Acad Dermatol 1995;33:973-8.

12. Roche WR. Fibroblasts and extracellular matrix in bronchial asthma. In: Busse WW, Holgate ST, editors. Asthma and rhinitis. Boston: Blackwell Scientific Publications;1995. p.554-62.

13. Dahlen B, Shute J, Howarth P. Immunohistochemical localisation of the matrix metalloproteinases MMP-3 and MMP-9 within the airways in asthma. Thorax 1999;54:590-6.

14. Ohno I, Ohtani H, Nitta Y, Suzuki J, Hoshi H, Honma M, et al. Eosinophils as a source of matrix metalloproteinase-9 in asthmatic airway inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol 1997;16:212-9.

15. Stahle-Backdahl M, Sudbeck BD, Eisen AZ, Welgus HG, Parks WC. Expression of 92-kDa type IV collagenase mRNA by eosinophils associated with basal cell carcinoma. J Invest Dermatol 1992;99:497-503.

16. Okada S, Kita H, George G, Gleich G, Leiferman. Migration of eosinophils through basement membrane components in vitro: Role of matrix metalloproteinase-9. Am J Respir Cell Mol Biol 1997;17:519-28.

17. Birkedal-Hansen H, Moore WG, Bodden MK, Windsor LJ, Birkedal-Hansen B, DeCarlo A, et al. Matrix metalloproteinases: A review. Crit Rev Oral Biol Med 1993;4:197-250.

18. Liu CM, Shun CT, Cheng YK. Soluble adhesion molecules and cytokines in perennial allergic rhinitis. Ann Allergy Asthma Immunol 1998;81:176-80.

19. Mautino G, Henriquet C, Gougat C, Le Cam A, Dayer JM, Bousquet J, et al. Increased expression of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and loss of correlation with matrix metalloproteinase-9 by macrophages in asthma. Lab Invest 1999;79:39-47.

20. Bullen EC, Longaker MT, Updike DL, Benton R, Ladin D, Hou Z, et al. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 is decreased and activated gelatinases are increased in chronic wounds. J Invest Dermatol 1995;104:236-40.