서     론

   세포의 증식과 분화의 조절은 세포성장 자극인자와 억제인자의 균형에 의해 이루어지는데¹⁾ 암은 세포증식 및 성장 조절기전의 실조로 인해 형질변환이 일어나 변이세포가 비가역적으로 증식하게 되어 발생된다고 알려져 있다.²⁾ 세포주기 중 G1기는 세포증식여부에 가장 중요한 시기로 여기에 관여하는 세포성장 억제인자들에 대한 연구가 활발한데 면역조직화학적 연구방법은 비교적 믿을만한 검사방법의 하나로 현재 많이 이용되고 있다.³⁾ 하지만 각각 개별적으로 연구되어진 종양억제유전자들의 발현양상이 갖는 상호연관성이나 그 의미에 대한 연구는 아직 논란이 많은 상태이다. 즉 p53단백이 다른 종양억제유전자들의 발현 및 활성에 직간접적으로 영향을 주며 중요한 조절자로서의 역할을 한다는 것과 각 단백발현의 결과와 임상적 소견 및 병리학적 분화도 사이에 유의한 관련성이 있는지에 대해서는 아직 명확히 밝혀진 바가 없다. 두경부의 암종은 대부분이 편평세포암으로, 아직까지는 주로 종양의 크기, 침범부위 및 전이여부 등으로 정해지는 임상적 병기에 의하여 예후가 좌우된다고 알려져 왔으나⁴⁾ 최근에는 이러한 임상적 인자들 외에 좀 더 객관적인 종양세포의 생물학적 표지자가 요구되고 있다.⁵⁾ 이미 Apolinario 등¹⁾과 Lee 등²⁾은 면역조직화학적으로 단백발현된 양상과 생존률과의 비교연구를 통하여 각 유전자의 발현이 갖는 예후인자로써의 가치에 대해 논제를 제기한 바 있다. 이에 저자들은 편평세포암으로 진단된 구강암 환자의 파라핀포매조직을 이용하여, 면역조직화학적 연구방법을 통해 각 종양억제유전자의 발현양상이 갖는 상호연관성과 생존률에 대한 비교분석 및 원발병소의 병기, 경부림프절전이, 병리조직학적 분화도 등과의 관련성에 대한 통계적 분석을 통하여 종양억제유전자의 발현양상이 갖는 예후인자로써의 의의를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

연구대상 및 재료
   1980년 1월부터 1997년 12월까지 본원에서 구강 편평세포암의 진단 하에 수술 치료를 시행한 환자 중 방사선치료나 화학약물치료에 전혀 노출된 기왕력이 없으며 파라핀 포매 조직의 이용이 가능한 46명의 환자를 대상으로 하였다. 이중 병변에 대한 의무기록이 충분치 못한 6례는 각 단백 상호간의 분석시에만 포함하였고 임상적, 병리적 소견과의 상관관계 분석시에는 제외하였다. 환자의 평균나이는 56.7세로 31세부터 80세까지 다양했으며 남녀의 성비는 6：1(39：7)로 남자에서 빈발하였고 발생부위별 빈도는 설암이 24례로 가장 많았으며, 치주 8례, 경구개 8례, 구강저부 3례, 후구삼각부 2례, 구강점막 1례 순 이었다.

면역조직화학적 염색방법

   수술시 적출되어 파라핀 포매되어 보관중인 조직 중 종양세포가 가장 광범위하게 포함된 것을 골라 5 μm 두께의 연속 절편으로 만들어 silanized slide(DAKO corp.)에 부착시켰고, Xylene에 각각 10분간씩 3회 담가 탈파라핀화 과정을 거친 후 100%, 90%, 80%, 70% 에탄올에 3분간씩 처리하여 함수과정을 거쳤으며 내인성과산화효소의 활성을 억제시키기 위하여 메탄올­과산화수소용액(100% methanol 160 ml＋30% H₂O₂ 4 cc)에 10분간 처리하였다. pH 7.6의 Tris 완충액으로 5분간씩 3회 세척하였고 각각의 슬라이드는 pH 6.0 citrate buffer 용액에 충분히 잠기게 하여 microwave oven에서 15분간 가열하였다. 상온에서 PBS 용액에 20분간 방치하여 냉각한 후 각 단백에 대한 일차항체를 반응시켰는데 p53에 대한 일차항체는 mouse monoclonal antibody인 clone 1801(BioGenex, USA)를 1：50으로 희석하여 사용하였고, p21에 대한 일차항체는 mouse monoclonal antibody인 clone EA10WAF1(Ab-1).(Calbio, England)를 1：20으로, bax에 대한 일차항체로는 rabbit polyclonal antibodies인 bax(Ab-1).(Calbio, England)를 1：20으로 희석하여 각각 37°C에서 2시간동안 반응시켰다. 그 후 avidine-biotin peroxidase complex(Dako LSAB ＋kit, Denmark)와 결합된 이차항체를 가하고 37°C에서 30분 반응시킨 후 Tris 완충액으로 세척하였고 streptavidin과 반응시킨 후 발색제로는 3,3-diamino-benzidine-tetra-hydrochloride(DAB；Dako LSAB ＋kit, Denmark)를 반응시켜 세척하였으며 Meyer's hematoxylin으로 대조염색을 실시하여 광학현미경 하에서 관찰하였다.

면역조직화학적 염색의 결과 판정

   현미경관찰은 종양의 중심부를 선택하여 시행하였으며,²⁾ 100배와 400배(0.18 mm²) 광학현미경 하에서 판독하였고 백분율은 400배 현미경소견 하에서 시행하였다.1) p53과 p21은 검경 시야에서 세포의 핵 안에 분명한 갈색의 과립성 반응을 보일 때⁶⁾⁷⁾(Figs. 1 and 2), bax는 세포질 내에서 분명한 갈색의 반응이 보일 때 의미있는 것으로 판독하였다(Fig. 3).¹⁾⁸⁾ p53과 p21의 양성기준은 전체 핵에서 염색된 핵의 백분율이 10% 이상인 경우로 정하였고⁹⁾¹⁰⁾ bax는 세포질에서의 발현률이 25%이상인 경우로 정하였다.⁸⁾ 생존률은 Kaplan-Meier 방법을 사용하였고 Log-Rank test로 평가하였다. 각 유전자단백질의 발현률과 원발병소의 병기, 경부림프절전이의 유무, 조직학적 분화도 등과의 상관성여부에 대한 통계학적 검증은 Fisher's Exact test(2-Tail)를 시행하였고 유의수준은 p<0.05로 정하였다. 통계적 분석은 SAS 6.12(Cary, NC, USA)를 사용하였다.

결     과

   p53의 양성발현은 총 46례중 25례로 54.4%의 양성발현률을 보였고, p21은 27례로 58.7%, bax는 12례로 26.1%의 양성발현률을 보였다(Table 1). p53음성/p21양성 발현된 예는 15례로 전체의 32.6%였고 p53음성/bax양성 발현된 예는 8례로 17.4%였다. p53이 발현되지 않고 p21이 양성발현된 예와 p53이 양성발현되고 p21이 발현되지 않은 예는 총 28예로 그 이외 그룹인 18예보다 많았으나 의미있는 차이는 없었으며(p＝0.140), p53이 발현되지 않고 bax가 양성발현된 예와 p53이 발현되고 bax가 발현되지 않은 예는 총 29예로 그 이외 그룹인 17예보다 많았으나 이 역시 의미있는 차이를 보이지는 않았다(p＝0.107)(Table 2). p53의 양성발현률은 원발병소의 병기가 높을수록 의미있게 증가되었으며, bax는 역으로 원발병소의 병기가 높을수록 양성률이 의미있게 감소되었다. 하지만 경부림프절전이의 유무, 조직학적 분화도 등과는 유의한 관련성을 발견할 수 없었다. p21에서도 원발부위의 병소의 크기, 경부림프절로의 전이여부, 병리조직학적 분화도와는 관련성이 없었다(Table 3). 단백발현양상이 갖는 예후인자로써의 가치를 평가하기 위해 Kaplan-Meier방법을 이용하여 p53, p21, bax 각각의 단백발현양상 및 p53과 p21, p53과 bax 단백발현조합군들에서의 생존률을 비교하였으나, 모든 그룹간에서 통계학적으로 유의한 생존률의 차이는 관찰되지 않았다(Fig. 4).

고     찰

   종양억제유전자들 중 p53은 사람의 17번 염색체의 단완(17p13.1)에 위치하는 53 KD의 핵인단백질로 11개의 exon으로 이루어져 있다.³⁾¹¹⁾ 야생형의 p53유전자는 스트레스 상황이나 DNA에 대한 손상이 생기면 세포를 세포성장주기의 G1기에 정지하게 하고 다른 암억제유전자를 활성화시킴으로써 세포의 증식과 변형을 억제하는 역할을 하지만,^3)11)12) 유전자의 돌연변이(대부분 95% 이상 exon 5번부터 8번 지역의 점 돌연변이)⁴⁾가 생기게 되면 암억제 기능을 하지 못하는 변이형 p53단백이 되어 세포에 축적되며, 변이형 p53은 비정상적으로 긴 반감기를 갖게 되어 항체를 이용한 면역조직화학적 검사로 검출이 가능하게 된다.^2)7)11) p53은 두경부를 비롯하여 피부, 폐, 유방, 난소, 식도 및 대장 등에서 발생하는 악성종양 중에서 가장 흔히 돌연변이되는 종양억제유전자로 그 변이율이 유방암의 경우 10~40%,³⁾ 폐암¹⁾과 위암¹¹⁾의 경우 64% 등으로 대부분의 암종 중 약 50%에서 발현된다고 알려져 있는데¹²⁾ 두경부암에서도 양성발현률이 약 40~60%로 보고되고있다.^13)18)22) p21은 세포성장 및 자사(Apoptosis)에 중요한 역할을 하는 세포성장 조절요소의 하나로써¹²⁾ 정상표피세포에서도 관찰된다.¹¹⁾ Cyclin-cdk 복합체에 작용하여 세포활성을 방해하며, 결과적으로 세포주기에서 S기로의 진행을 막아(G1 arrest) 종양발생을 억제하는데³⁾¹¹⁾ 자연적인 세포자사와 손상된 유전자의 복구(DNA repair)에도 관여한다.¹¹⁾ p21유전자는 간, 근육, 피부, 조혈계에서 세포분화 및 성장의 중요한 조절자 역할을 하며¹⁴⁾ 발현률은 위암에서 약 32%,¹¹⁾ 췌장암에서 약 57%¹²⁾로 보고되었는데 p21의 표현강도는 성, 조직형, 종양크기와는 연관이 없다고 알려져 있다.¹¹⁾ 본 연구대상인 구강암에서의 p21단백양성률은 58.7%로 Dergham 등¹²⁾의 보고와 비슷하였으나 Kudo 등¹⁸⁾이 보고한 77%보다는 낮았다. bax단백은 bcl-2와 이종결합체(Heterodimer)를 형성할 수 있는데 bax/bcl-2의 비가 클수록 세포자사를 촉진하는 역할을 한다.⁸⁾ bax의 발현률은 선암에서 71% 정도로 특히 높고, 편평세포암에서는 35%정도로 보고되고 있는데¹⁾ Fracchiolla 등²²⁾은 후두암에서 68%의 높은 양성률을 보고하기도 하였다. 본 연구대상에서의 bax 발현률은 26.1%로 이전의 보고에서보다 낮았다. 성별로는 남성에서 더욱 높은 발현률을 갖는다고 알려져 있다.¹⁾ 이상의 각 단백 발현률이 갖는 임상적 의미에 대한 연구 중에서 p53단백발현률이 임상적 병기나⁴⁾¹³⁾ 병리조직학적 분화도와는¹³⁾ 상관관계가 있어 위, 장관 및 식도암, 폐암의 예후예측인자로써 가치가 있다는 주장도 제기된 바 있는데¹¹⁾¹⁵⁾ 특히 구강 및 구인두암에서 원발부위의 병기가 증가함에 따라 p53단백 양성발현률이 증가함을 보고하여 본 연구에서와 유사한 결과를 얻은 바 있다. 또한 Field 등¹¹⁾은 말기 두경부 편평세포암 환자에서 p53양성발현된 군이 그렇지 않은 군보다 예후가 더욱 나빴으며 이는 p53이 특히 말기 암 환자의 생물학적 성상에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되어진다고 설명하였고, Kim 등⁴⁾과 Hur 등⁵⁾ 및 Tatemoto 등¹⁹⁾은 p53이 제한적이지만 예후예측인자로써의 의미가 있음을 주장하였다. p21의 임상적 의미에 대하여 Gomyo 등¹⁶⁾과 Dergham 등¹²⁾은 p21 양성군이 음성인 군에서보다 5년 생존율이 더욱 높았으며 췌장암과 진행된 위암환자에서 p21 양성군이 수술 후 화학치료 및 방사선치료에 있어서 더욱 예후가 좋았음을 보고하고 이로써 p21이 췌장암 및 진행된 위암환자의 술 후 관리에서 유용한 표지자 역할을 할 수 있다고 하였다. Bax의 임상적 의미에 대한 연구에서 Krajewski 등¹⁷⁾은 진행된 유방암환자에서 bax단백양성률이 감소되면 약물치료의 반응성을 떨어뜨리고 생존률을 감소시킨다고 보고하였고, Apolinario 등1)은 폐암환자의 연구에서 bax단백 단독으로는 생존률에 미치는 연관성을 발견하지 못했으나 bax＋/bcl2- 군에서 bax＋/bcl2＋ 군에 비해 통계학적으로 의미있게 예후가 나빴다고 보고하였다. 특히 Xie 등²⁰⁾은 설암에서, Ito 등²¹⁾은 구강 및 구인두암에서 bax가 매우 유용한 예후인자로써의 가치가 있음을 보고한 바 있다. 하지만 본 연구에서는 p53, p21, bax 단백발현양상과 생존률 사이에 통계적으로 유의한 연관관계를 발견하지는 못하였다. 각 단백간의 상호관계에 있어 p53과 p21이 상호 역관계를 형성하는 것으로 볼 때³⁾¹²⁾ p21이 p53에 의해 조절된다고 생각되어져 왔으나, 최근에는 p21과발현이 야생형 p53에 의해 일부 조절되기도 하지만 아직 알려지지 않은 또 다른 경로에 의해서도 조절된다는 보고^3)7)11)도 있으며 전혀 관련이 없다는 보고¹⁸⁾도 있다. 즉 p21이 p53 비의존성 경로에 의해서도 유도되므로 p21양성률이 p53의 기능적 상태를 직접 반영하지는 못하며⁷⁾¹¹⁾ 두 단백간의 조절여부를 이것만으로는 판단하기 힘들다.⁷⁾ bax 역시 p53에 의해 조절되며 상호 역 상관관계를 보인다는 보고¹⁾⁸⁾와 서로 관련이 없다는 보고²²⁾가 엇갈리고 있으며 현재까지도 논란중이다. 각 단백의 발현양상과 예후예측인자로써의 의미에 대해서는 많은 연구가 있어왔는데¹¹⁾ 특히 Kudo 등¹⁸⁾은 p53(­)/p21(＋)군이 다른 군들에서보다 생존률이 통계적으로 의미있게 높아 예후적 가치가 있음을 보고한 바 있다. 현재에도 여러 유전자에 대한 연구가 진행되고 있으나, 아직까지 암의 발생과 진행과정 및 예후와의 관련성에 대해서 일치된 의견은 없으며,1) 이는 암유전자 중 어느 한가지만이 아닌 복합적인 요소들이 환자의 생존 및 예후에 영향을 끼친다는 것을 보여주는 것이라 하겠다.

결     론

   Bax와 변이된 p53단백은 종양의 원발부위 크기와 통계학적으로 유의한 상관관계를 보이는 것으로 나타나 p53과 bax단백이 구강암의 진행정도를 예측할 수 있는 인자인 것으로 사료된다. Kaplan-Meier 생존률 분석에서는 각 단백발현률이나 각 단백발현률의 조합군에서 유의한 연관성을 얻지 못하였는데 이는 생존추적이 가능한 연구대상군의 수가 통계적 의의를 갖기에 부족하였기 때문으로 생각되며 향후 더 많은 대상군을 이용한 추가적인 연구를 통해 예후인자에 대한 분석이 필요할 것으로 사료된다.

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