서
론
All-trans-retinoic acid(RA)는 비타민 A의 유도체로 조직의 발생 및 발달, 세포의 증식 및 분화, 면역 기능, 조혈
기능 등 여러 가지 생물학적 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.1-4)
세포증식에 대한 RA의 기능은 정상 상피세포의 증식을 억제하기도 하며 또한 촉진시킬 수 있다고 알려져 있으나 이러한 역할의 차이는 배양액의
조건에 따라서 나타날 수 있으며 특히 성장인자가 함유된 배양액에서는 RA가 각질형성세포의 증식을 억제한다고 보고되었으며5)6)
그 외에 RA의 농도에 따라서도 각질형성세포의 증식에 대한 효과가 다르다고 보고되었다.7)8)
진주종이란 상피세포가 과증식의 상태가 되고 각질화(keratinization)되면서 케라틴을 축적하여 골파괴를 일으키는 질환이다. 진주종의
발병 기전에 여러가지 성장 인자들이 관여하며, 정상 각질형성세포와 진주종에서 배양된 각질형성세포는 이러한 성장 인자들의 분비 정도에 차이가
있으며 서로 다른 생물학적 특성을 보인다.9-12)
RA가 정상 각질형성세포 증식을 조절하는 효과가 진주종의 각질형성세포의 증식에 어떠한 영향을 나타내는지는 알려져 있지 않다. 본 연구는
외이와 진주종 조직에서 배양한 각질형성세포에 RA를 투여하여 각질형성세포의 증식이 억제되는지 또는 촉진되는지에 대한 효과를 알아보려고 시도하였으며,
이러한 효과가 RA의 농도에 따라서 정상과 진주종의 각질형성세포에서 차이가 있는지를 분석하였다.
재료 및 방법
각질형성세포의 초대 배양(primary culture)
각질형성세포는 Yoon 등12)의 방법을 이용하여 무혈청 배양액인 Medium 154(Cascade Biologics
Inc., USA)와 각질형성세포 증식촉진인자(human keratinocyte growth supplement:HKGS, Cascade
Biologics Inc., USA)를 이용하여 배양 증식시켰다.
수술시 얻은 외이의 피부와 진주종 조직에서 0.4% dispase를 이용하여 각질형성세포를 분리한 후, fetal bovine serum(FBS,
Gibco BRL Life Technologies Inc., USA)을 넣어 1~2분간 pipette을 이용하여 흡인 배출을 반복하는 진탕으로
낱개의 세포로 유리한 다음 1400~1500 rpm에서 원심 분리하여 상청액은 버리고 침전된 세포들에 배양액을 넣은 후 다시 진탕하여 부유시켰다.
세포 부유액을 25 cm2 culture flask(Nunc, Denmark) 한 개당 5×105개의 세포를 분주하고 5%
CO2 배양기에서
각질형성세포가 단층으로 flask의 전면을 덮도록 자랄 때까지 이틀에 한번씩 상층의 배양액을 교환하면서 약 2주 내지 4주간 배양하였다.
각질형성세포의 계대 배양(subculture)
초대 배양 후 배양기에 가득 차게 배양된 세포를 phosphate buffered saline(PBS, Sigma Chemical Co.,
USA) 용액으로 2회 세정하고 0.05% trypsin-0.02% EDTA(Gibco BRL Life Technologies Inc.,
USA) 용액을 배양액의 절반만큼 넣은 다음 CO2 배양기에서
8~10분간 배양한 후, FBS 용액을 1.5~2 ml 넣고 1400~1500
rpm에서 원심 분리하였다. 상청액은 버리고 침전된 세포들에 배양액을 넣은 후 다시 진탕하여 부유시킨 다음, 다시 한번 1500 rpm에서
원심 분리한 후 상청액은 버리고 침전된 세포들에 배양액을 넣은 후 새로운 flask에 분주시키고 배양하였다.
RA 농도에 따른 각질형성세포의 성장
Cell Titer 96TM AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay 방법(Promega
Corp., Technical bulletin)을 이용하여 RA의 농도에 따른 세포 증식의 차이를 조사하였다. 초대 배양이나 계대 배양하여
세포가 배양 용기의 바닥에 포화(confluence)되면, 세포를 flat bottom 96 well plate에 각 well 당 5×103개씩 세포를 분주하여 medium 154에 넣어 24시간 동안
CO2 배양기에서 배양한 다음 medium 154를 갈아주면서 3일 간격으로
2번 RA를 10-6M 및 10-7M의 농도로 첨가하였고, 각각의 대조군으로는 RA를 첨가하지 않은 것으로 하여 총 7일간 각질형성세포를
배양하였다. 배양된 각 well에 MTS 용액(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(-4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,
inner salt)과 PMS 용액(phenazine methosulfate)을 20:1로 섞은 용액을 20 μl씩 첨가한 후
37°C에서 CO2 배양기에서 배양하면서 formazan이 형성되어지면 분광 비색계(multiwell scanning spectrophotometer)로
490 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도는 살아있는 세포의 수와 직접 비례하는데 측정한 흡광도에서 세포 배양액만을 넣은
군의 흡광도를 뺀 실흡광도(net absorbance)를 구하고, RA를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 생존 분획(survival fraction)을
아래와 같은 공식을 이용하여 계산하였다.
Survival fraction(%)=
Test group Abs-Blank Abs*
----------------------- ×100
Control group Abs-Blank Abs
모든 실험은 8개 well을 한 실험군으로 시행하였으며 측정된 흡광도 중 최고치와 최저치를 뺀 6개를 의미있는 값으로 취하였고 서로 독립된
실험을 외이 피부의 각질형성세포는 5회, 진주종의 각질형성세포는 2회 시행하였다. 외이 피부의 실험에서 제 1 군과 3 군은 2차 계대
배양된 세포를, 제 2 군과 5 군은 1차 계대 배양된 세포를, 제 4 군은 초대 배양된 세포를 이용하였으며, 진주종의 실험에서는 제 1
군 및 2 군 모두 초대 배양된 세포를 이용하였다.
통계처리
SPSS software를 이용하여 RA 농도에 따른 생존 분획의 차이와 외이와 진주종 각질형성세포의 RA 투여에 의한 성장의 차이를 Wilcoxon
signed rank test로 분석하였고, 통계적 유의성은 p<0.05로 검정하였다.
결 과
각질형성세포의 실흡광도
외이 및 진주종에서 분리한 각질형성세포의 실흡광도는 대조군에 비하여 RA 10-6M의 농도 투여군에서 모두 낮았고 RA 10-7M의
농도 투여군에서는 모두 높았다. 외이 각질형성세포의 평균 실흡광도는 대조군에서는 1.485±0.460, RA 10-6M의 농도에서는 1.156±0.473,
RA 10-7M의 농도에서는 1.986±0.651이었다(Table 1). 진주종 각질형성세포의 평균 실흡광도는 대조군은 1.180±0.425,
RA 10-6M의 농도에서는 0.971±0.189, RA 10-7M의 농도에서는 1.314±0.375이었다(Table 2).
각질형성세포의 생존분획
외이에서 분리한 각질형성세포의 생존분획은 대조군 100%에 비하여 RA 10-6M의 농도에서 79.3±35.3%로 세포 증식이 억제되었고(p=0.001).
RA 10-7M의 농도에서는 134.2±45.4%로 세포 증식이 촉진되었다(p=0.002). 진주종에서 분리한 각질형성세포의 경우 RA
10-6M의 농도에서 85.8±19.1%로 세포 증식이 억제되었고(p=0.023), RA 10-7M의 농도에서는 111.1±10.7%로
세포 증식이 촉진되었다(p=0.004). 외이나 진주종의 각질형성세포 모두에서 대조군에 비하여 RA 10-6M의 농도에서는 세포 증식이
억제되었고 RA 10-7 M의 농도에서는 세포 증식이 촉진되었다(Fig. 1).
고 찰
진주종이란 점막으로 구성된 중이강 내로 외이도나 고막의 표피 상피가 자라 들어가면서 과증식의 상태와 각질화 상태가 되면서 케라틴이라는 물질이
축적되어 주위의 골조직을 파괴하는 질환이다. 진주종의 발병 기전에 영향을 미치는 여러 가지 요인들을 파악하는 것이 이 질환의 예방이나 치료에
중요하다.
정상 피부의 표피층은 중층 편평 상피(stratified squamous epithelium)로 이루어져 있고 여러 층의 각질형성세포(keratinocyte)가
주요한 구성요소이다. 기저층의 각질형성세포는 증식성의 능력이 있어서 DNA의 합성과 유사분열(mitosis)이 일어나며 세포는 분화의 과정을
거치면서 유극층, 과립층, 각질층의 순서로 외측 방향의 피부표면으로 이동하여 결국은 각질화(keratinization)의 상태가 되어 케라틴이라는
분비물이 떨어져 나가게 된다.7) 정상 피부에서 각질형성세포의 성장과정에서 증식과 분화 사이에는 균형이 존재하여
이러한 균형 상태는 여러 가지 성장 인자(growth factors)나 calcium ion 등에 의하여 조절되고 있다. 특히 성장 인자들은
세포의 증식과 분화를 조절하는 작용 이외에 세포의 표현형(phenotype)을 유지하는데 있어서 여러 종류의 단백질을 합성하는데 관여하고
있다.
Retinoic acid(RA)는 비타민 A의 유도체로써 조직의 발생 및 발달, 세포의 증식 및 분화, 면역 기능, 조혈 기능 등 여러
가지 생물학적 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 여러 조직의 세포에서 성장에 관여하여 세포의 증식과 분화를 조절하는
작용이 있어서 여러 종류의 암의 예방이나 치료제로 많은 연구가 진행되어 왔다.
RA는 정상 상피세포의 성장 및 분화에 많은 영향을 미치며 정상 각질형성세포를 배양했을 때 비교적 높은 군락 형성능을 보이며 형태학적으로
미분화된 상태로 나타난다. 상피세포의 편평 상피화 현상은 retinol 혹은 RA에 의해 억제되고 지방 성분이 없는 배지에서는 촉진된다.8)
또한 비타민 A가 결핍된 동물실험에서 섬모 상피세포로 구성된 호흡기의 점막이 비정상적인 분화 과정을 거쳐서 각질을 형성하는 편평세포로 변하는
편평 상피화생(squamous metaplasia)이 일어나며 비타민 A를 투여함으로써 정상적인 상태로 회복될 수 있음이 밝혀졌다. 특히
비타민 A의 유도체인 RA는 여러 부위의 상피세포 중에서 표피층의 각질형성세포의 증식과 분화의 조절에 매우 중요한 역할을 하며8)
외이도의 피부를 배양한 후 RA를 투여하면 외이도 피부의 표피층의 중층 편평 상피세포(stratified squamous epithelium)가
분비성의 점막 상피로 전환된다고 보고되었다.14)
RA의 세포 성장에 대한 효과는 배양액의 상태나 투여한 RA의 농도에 따라서 차이가 있다. 성장 인자가 함유된 배양액에서는 RA 투여로써
각질형성 세포의 증식을 억제하는 것으로 알려져 있고5)
무혈청의 성장 인자 결핍 배지에서는 RA 투여로써
epidermal growth factor(EGF)가 DNA 합성을 자극하는 효과를 증진시킨다고 알려져 있다.5)6)
고농도인 10-6M의 RA는 정상 각질형성세포의 증식을 억제하나, 10-6-10-6M의 RA는 각질형성세포의 증식과 세포의 이동을
증가시킨다고 보고된 바 있다.7)8)
배양세포를 이용한 실험을 시행함에 있어서 필수적인 요소는 같은 시기의 세포를 사용하는 것이나 아직도 외이나 진주종의 각질형성세포를 배양하는
데는 여러가지 기술상의 문제점이 있어서 많은 양의 세포가 요구되는 실험을 시행하는 경우에는 이러한 조건을 만족하지 못하기도 한다. 그러나
본 연구에서와 같이 각각 다른 시점의 세포를 이용하는 경우에 결과를 분석하고 해석하는 데는 세심한 주의를 요한다. 본 연구에서 외이와 진주종
조직에서 배양된 각질형성세포에서 관찰한 실흡광도는 RA를 투여하지 않은 대조군에 비하여 10-6M의 RA를 투여한 모든 경우에 세포 증식이
억제되었음을 관찰하였고, 10-6M의 RA를 투여한 모든 경우에 세포 증식이 촉진됨을 관찰하였다. 이러한 결과는 RA의 정상 상피세포
성장에 대한 효과는 투여한 RA의 농도에 따라서 차이가 있다는 이전의 보고들7)8)을
확인하였고 또한 이러한 효과가 진주종의 각질형성세포에서도 나타남을 알 수 있었다.
본 연구에서 RA의 투여로 외이와 진주종의 각질형성세포의 증식에 차이가 있는지를 알아보기 위하여 생존분획의 결과를 비교하였다. RA 10-6M의 투여 농도에서 생존분획은 정상 외이의 각질형성세포가 79.3%에 비하여 진주종의 각질형성세포는 85.8%로서 진주종에서 RA의
영향을 더 적게 받아 세포 증식의 억제효과가 적은 양상을 보였으나 두 군간에 통계적인 유의성은 없었다. 그러나 앞으로 10-6M보다 고농도의
RA의 투여로서 두 조직간에 세포 증식의 억제효과가 차이가 있을지를 규명하는 것은 필요한 과제라고 할 수 있다. 반면 RA 10-7M의
투여 농도에서 세포증식의 억제효과가 생존분획은 정상 외이의 각질형성세포가 134.2%에 비하여 진주종의 각질형성세포는 111.1%로서 통계적으로
유의하게 진주종에서 세포증식의 촉진효과가 적음을 알 수 있었다(p=0.002). 이러한 결과는 RA의 투여로서 진주종의 상피세포는 정상
외이의 상피세포에 비하여 세포증식의 촉진효과가 저하되고 있음을 암시한다.
RA를 투여한 후 진주종의 상피세포와 정상 외이의 상피세포사이에 세포증식의 억제효과나 촉진효과가 차이가 있는지 그리고 진주종의 상피세포에서
외이의 상피세포보다 촉진효과가 적게 나타나는 이유에 대하여는 아직 밝혀지지는 않았다. 진주종의 조직에서 시행한 면역조직학적 검사는 진주종
조직에서 EGF, TGF, TNF-α, FGF 그리고 IL-1과 IL-8 등의 성장 인자들의 발현이 증가된 것이 알려져 있고9-11)
배양된 진주종의 상피 세포에서 외이도 상피 세포에서보다 IL-1과 IL-8의 발현이 증가된 것이 밝혀진 것과 같이12)
진주종 조직과 외이 상피세포사이에 여러가지 성장 인자들의 분비의 차이에 따른 생물학적 특성이 RA의 투여에 대한 각질형성세포의 증식에 어떠한
영향을 미칠 수 있을 것으로 추측한다. 그러나 진주종 조직에서 나타나는 성장인자의 분비증가는 어떠한 기전으로 RA의 각질형성세포 증식에
대한 촉진효과가 외이에 비하여 진주종에서 더 적은지는 앞으로 규명해야 할 과제이다.
본 연구는 RA의 투여가 진주종 상피세포의 성장에 미치는 효과를 알기 위한 초보적인 시도로서 어떠한 결론을 내리는 데는 한계가 있으므로
더 많은 연구가 보충되어야 하는 필요성이 있음은 분명하다. 비록 RA가 정상 상피세포에 미치는 영향에 관하여는 많은 연구가 진행되어 왔지만
진주종의 상피세포에 어떠한 영향이 있는지에 대한 연구는 아직도 매우 미비하다. 최근 RA의 투여가 진주종의 상피세포에서 미치는 효과를 본
실험에서 RA의 투여가 진주종 상피세포의 이동을 억제한다고 보고15)와 같이 이러한 연구는 RA가 진주종의
발생 기전을 조절하는데 어떠한 역할을 하는지를 밝힐 수 있는 근거를 제시해 주는 시도의 일환으로 향후 RA의 투여가 진주종의 예방이나 치료에
임상적으로 적용할 수 있는지를 가늠하는 계기가 될 수 있다고 생각한다.
결 론
외이와 진주종 조직에서 각질형성세포를 배양한 후 RA를 10-6M 및 10-7M의 농도로 투여한 결과는 외이와 진주종 조직에서 추출한
각질형성세포 모두에서 고농도(10-6M)의 RA는 세포의 증식을 억제하고, 저농도(10-7M)의 RA는 세포의 증식을 촉진하는 효과를
관찰하였다. RA의 투여후 각질형성세포에 대한 증식의 촉진효과가 진주종 조직에서 외이에서 보다 더 적게 나타남을 알 수 있었다. 이러한
결과는 RA의 투여 효과는 농도에 따라 진주종 각질형성세포의 증식을 억제하거나 촉진하는 작용이 있음을 시사한다.
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