서     론

   동물에서 알레르기 비염 모델을 만드는 것은 알레르기 기전에 대한 연구와 알레르기 비염에 대한 효과적인 치료법을 찾는데 매우 중요하다. 그러므로 과거부터 마우스, 백서 그리고 기니픽 등에서 여러 가지 다양한 항원을 이용한 모델이 연구되어 왔다. 그중 난알부민(ovalbumin)이 동물에서 알레르기 반응을 유발하는데 가장 흔히 사용되는 항원이지만¹⁾ 흔한 알레르기 항원이 아니라는 점이 실제로 임상 적용에 한계가 있다. 알레르기 항원 중에서 집먼지 진드기(house dust mite)는 알레르기 질환의 가장 흔한 원인으로써 Dermatophagoides farinae(Der f, 북아메리카 집먼지 진드기)와 Dermatophagoides pteronyssinus(Der p, 유럽 집먼지 진드기)가 중요한 원인으로 알려져 있다.²⁾ 집먼지 진드기 항원을 이용하여 마우스에서 알레르기 동물 모델을 제작한 연구는 최근 활발하게 진행되고 있다. Cheng 등³⁾은 마우스에서 Der p를 이용한 알레르기 동물 모델을 제작하였고, Yu 등⁴⁾은 Der f의 항원 추출물(crude extract)을 사용하여 전신 감작(systemic sensitization) 및 비내 국소감작(intranasal sensitization)을 하여 폐조직의 호산구 침윤의 증가를 보고했으며, 최근에는 비내 국소감작만으로도 폐조직의 호산구 침윤의 증가와 Der f 특이 IgE 항체의 증가를 보인다고 하였다.⁵⁾ 그러나 이들 연구에서 전신 감작과 비내 국소감작을 비교하여 알레르기 동물 모델을 만든 보고는 없었다.
   그러므로 본 연구에서는 마우스에서 Der f를 전신 감작 및 비내 국소감작을 시키거나 전신 감작 없이 비내 국소감작만 시켜 알레르기 비염 모델을 각각 만든 후에, 이들 마우스에서 비염 증상, 비점막 호산구 침윤 정도, 그리고 혈청내 항원 특이 IgE 항체 수치를 비교하여, 마우스에서 알레르기 비염을 보다 효과적으로 유발할 수 있는 방법을 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

실험동물과 집먼지 진드기 항원

   실험동물로는 (주) 대한실험동물에서 구입한 체중 20~30 g의 specific pathogen free의 C57BL/6(H-2b)계 숫컷 마우스 20마리를 사용하였다.
   항원으로는 Allergopharma Co., Ltd.의 협조로 집먼지 진드기인 Dermatophagoides farinae(Der f)의 lyophilized crude body extract를 구하여 사용하였다. 항원은 4°C에서 냉장 보관하였고 phosphate-buffered saline(PBS)에 녹여 사용하였다.

알레르기 비염 모델의 제작
   C57BL/6 마우스를 다음과 같이 세 그룹으로 나누어 사용했다. 전신감작 과 비내 국소감작을 모두 시킨 A군, 비내 국소감작 만을 시킨 B군, 그리고 대조군인 C군으로 나누었다.
   실험군 A의 마우스에게 Der f 100 μg을 녹인 PBS 100 μl에 동량의 Complete Freunds Adjuvant(CFA, PIERCE, USA)를 한시간 이상 흔들어 섞은 혼합액 200 μl를 마우스의 tail base에 피하주사하여 항원에 전신 감작시켰다. 또한 실험시작 24시간 후와 72시간 후에 마리당 pertussis toxin 300 ng을 복강내 주사하였다. 7일 후에 동량의 진드기 항원을 Incomplete Freunds Adjuvant(IFA, PIERCE, USA)에 녹여 혼합액을 피하주사하였다.
   전신감작을 시킨 후 6주일간 1주일마다 한번씩 micropipette을 이용하여 20 μg의 Der f를 20 μl의 PBS에 녹인 용액을 마우스의 양측 비강에 10 μl씩 비내 점적(intranasal instillation)하여 비내 국소감작을 유도하였다(Fig. 1).
   실험군 B의 마우스에게는 항원이 섞이지 않은 CFA를 주사하고 이후 1주일마다 6주간 실험군 A에서처럼 항원을 PBS에 녹인 용액을 비내 점적을 시행하여 비내 국소감작 만을 유도하였다. 대조군인 실험군 C의 마우스에게는 항원이 섞이지 않은 CFA를 주사하고 이후 1주일마다 6주간 동량의 PBS 만을 비내 점적하였다.

항원 투여 후 유발된 알레르기 증상의 비교
   마지막 비강내 점적 1주일 후 모든 실험군에 20 μg의 Der f 용액 20 μl를 micropipette을 이용하여 비내 점적하여 항원주입에 의한 알레르기 반응을 유도하였다. 항원 주입 후 15분간 마우스의 코를 비비는 동작과 재채기 숫자를 기록하여 각각 합산하여 이를 증상점수(symptom score)로 정의하여 각 실험군의 결과를 서로 비교하였다.

비점막내 호산구의 침윤 정도의 비교
   항원 주입 후 24시간 후에 마우스를 희생시켜 비중격 점막을 채취하였다. 즉시 4% paraformaldehyde로 10~16 시간 동안 4°C 냉장실에서 조직고정을 한 후에 흐르는 물에 세척한 후 80% 이상의 알코올로 3~4시간에 걸쳐 단계별로 농도를 높여가며 탈수하여 파라핀 블록으로 만들었다. Hematoxyline-Eosin 염색을 시행하여 200배 광학 현미경(Laborlux K, Leica, Stgallen. Switzerian) 하에서 관찰하여 상피하 부위 5곳에서 실험과정을 모르는 두 사람이 각각 호산구의 수를 측정하여 각 실험군의 평균치를 비교하였다.

Der f-specific IgE 항체 농도 측정
   각 실험군의 마우스에서 비중격 점막 채취 시에 심장천자를 통하여 혈액을 채취하여 원심분리를 통해 적혈구는 버리고 혈청을 획득하였다. Der f-specific IgE 항체 농도는 다음과 같이 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다. 사용한 시약은 특별한 언급이 없는 것은 모두 Sigma Chemical Co.(St. Louise, MO, USA)의 제품을 사용했다.
   Bicarbonated coating buffer(pH 9.6)에 Der f 추출물을 녹인 용액을 ELISA plate의 각 well에 100 μl씩 넣은 다음 4°C에서 하루동안 유치(incubation)시켰다. 이렇게 Der f 항원을 바닥에 coating시킨 plate를 5% skim milk 용액으로 1시간동안 넣어 blocking을 시켰다. 3번이상 PBS-Tween 버퍼용액으로 씻어낸 다음, PBS에 10배 희석한 혈청 100 μl를 plate의 각 well에 넣은 다음 상온에서 1시간 동안 유치시켰다. 다시 plate를 PBS-Tween 버퍼용액으로 6번 씻어낸 다음 1：1000으로 희석한 HRP-conjugated rat antimouse IgE 항체(Southern Biotechnology Associates, Inc. USA)를 각 well에 넣은 후에 상온에서 1시간동안 유치시켰다. 다시 plate를 6번 PBS-Tween 버퍼용액으로 씻어낸 다음 o-phenyldiamine 4mg을 citrate phosphate buffer(pH 5) 10 ml에 녹인 다음 100 μl 씩 각 well에 넣어 암실에 30분간 두고 발색반응이 끝나면 2M H₂SO₄ 50 μl를 각 well에 넣어 반응을 정지시켰다. Spectro-photometer(Microplate Spectrophotometer System, Spectra MAX 250, Molecular devices, USA)를 사용하여 490 nm에서 optical density(OD₄₉₀)값을 구하였다.

통계처리방법
   실험군들의 각 데이터를 비교하기 위하여 Wilcoxon rank sum test 방법으로 p-value를 구하였으며 5% 유의수준에서 통계적 분석을 하였다.

결     과

항원 투여 후 유발된 알레르기 증상의 비교
   알레르기 유발군인 A군과 B군에서는 대조군인 C군보다 비 증상의 빈도가 증가하였다. 알레르겐 투여 후 15분간 측정한 코를 비비는 횟수와 재채기 횟수의 합인 증상점수는 A군의 경우 평균 21.1±4.1회로써 C군의 평균 13.3±3.8회보다 통계적으로 의미 있게 증가하였다(p<0.05). 비내 국소감작만을 시행했던 B군(18.8±6.8)에서도 C군보다는 증상점수가 증가하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의한 차이는 보이지 않았다(p>0.05, Fig. 2).

비점막내 호산구의 침윤 정도의 비교

   알레르기 실험동물의 비강 점막에서는 병리조직학적 소견상 염증세포 특히 호산구(eosinophil)의 침윤이 현저한 것을 볼 수 있었다. 호산구는 상피세포층보다 상피하 고유층에 주로 분포하였으며 상피하 고유층의 부종 소견도 일부에서 관찰되었다.
   알레르겐 투여후 24시간 후에 채취한 마우스의 비점막내에서 200배 광학현미경으로 관찰되는 호산구의 수는 A군의 경우 한시야당 평균 63.9±12.0개, B군의 경우 한시야당 평균 24.9±11.8개로써 호산구가 거의 관찰되지 않은 C군의 평균 1.7±2.2개보다 통계적으로 의미있게 증가하였다(p<0.01). 비내 국소감작만을 시행했던 B군과 전신감작과 국소감작을 모두 시행한 A군 사이에서도 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(p<0.01, Figs. 3 and 4).

혈청 Der f-특이 IgE 항체 농도 비교
   Der f 항원을 복강주사하고 6주간 매주 Der f 항원을 비내 감작시킨 A군의 경우 490 nm에서의 OD 수치(OD₄₉₀)가 0.31±0.1로써 대조군인 C군의 OD₄₉₀인 0.12±0.02 보다 높은 수치를 나타내어 A군에서 Der f-특이 IgE 항체 농도가 C군보다 통계적으로 의미있게 증가하였음을 알 수 있었다(p<0.01). 그러나 비내 국소감작만을 시행했던 B군(0.13±0.02)에서는 OD₄₉₀값이 대조군인 C군과 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않아 Der f-특이 IgE 항체가 거의 생성되지 않았음을 나타내었다(p>0.05, Fig. 5).

고     찰

   알레르기 비염 동물 모델을 만드는 것은 알레르기 기전에 대한 연구와 효과적인 치료법을 찾는데 매우 중요하므로 마우스, 백서 그리고 기니픽 등에서 여러 가지 다양한 항원을 이용한 모델이 연구되었다. 본 연구자들은 난알부민(ovalbumin)을 항원으로 하여 Wistar 백서에서 알레르기 비염 모델을 제작한 바 있다.⁶⁾ 즉 난알부민을 항원으로 하고 수산화 알루미늄 용액을 adjuvant로 사용하여 3차례 복강 주사함으로써 전신 감작을 시키고 난뒤, 1주일간 난알부민 용액을 비내 분무하여 국소 감작을 시켰다. 이때 측정한 비염증상, 비점막내 호산구의 수가 대조군보다 알레르기 비염을 유발한 실험군에서 통계적으로 유의하게 증가함을 관찰할 수 있었다.
   이렇게 난알부민이 동물에서 알레르기 반응을 유발하는데 가장 흔히 사용되는 항원이지만 두가지 점에서 임상에 응용하는데 문제가 있다. 하나는 난알부민이 흡입항원(aeroal-lergen)이 아니고 식이항원(food allergen)이라 알레르기 비염 같은 호흡기 질환에 응용하는데 다소 무리가 있으며 또 하나는 난알부민은 흔한 알레르기 항원이 아니라는 점이다. 더욱이 서로 다른 항원에 감작된 실험동물은 서로 상이한 호흡기 반응을 일으킨다는 보고도 있다. 즉 Arakawa 등⁷⁾은 난알부민 투여시엔 그 항원에 감작된 기니픽에서는 신속하게 발현되고 지속되는 기도 폐색을 유발하는 반면, trimellitic anhydride나 Der f는 서서히 발현되는 반응을 일으킨다는 보고를 하였다. 이는 항원의 물리화학적인 성상의 차이가 항원이 수지상세포 등의 항원인지세포와 만나기 위한 확산정도(diffusion)의 차이를 나타내는 것으로 추정되고 있다. 그래서 본 저자들은 알레르기 질환을 유발하는 제일 흔한 알레르기 항원으로 알려진 집먼지진드기 항원을 마우스에 감작시켜 알레르기 비염 모델을 제작하였다.
   집먼지 진드기 중에서 Der f와 Der p는 가장 중요한 allergen으로 몸체 추출물(crude body extract)에서 Def f1, Der f2, Der p1, Der p2 등의 알레르겐이 확인되었다.⁸⁾⁹⁾ 그리고 rDer f2 등의 재조합 진드기 항원(recombinant mite allergen)이 생산 가능하게 되어 알레르기 연구에 사용할 수 있게 되었다. 물론 정제 분리한 항원(purified allergen)이나 재조합 항원도 알레르기 반응을 유발하는 항원으로 사용할 수 있으나 본 실험에서는 가능한 자연 상태를 반영한다고 생각되는 Der f의 몸체 추출물(crude body extract)을 항원으로 사용하였다.
   실험동물로써 C57BL6 마우스를 사용하였다. 비록 마우스가 각종 알레르기 연구에서 백서나 기니픽보다 더 흔하게 사용되지는 않지만 백서나 기니픽과는 달리 마우스에서는 면역학적 정보(immunologic background)가 잘 확립되어 있고 면역학적인 연구를 시행하는데 필요한 각종 항체가 제품화되어 있어 마우스가 앞으로의 알레르기 비염 연구에 더 적합한 동물이라고 생각되었다.
   마우스의 종(strain)에 따라 알레르겐에 대한 반응 또한 차이가 많다. Der p에 대해 CBA, C57BL 등의 마우스는 혈청에서 높은 IgE 반응을 보이는 반면 C3H, BALB/C 등은 낮은 반응을 보인다는 연구 결과가 있었고¹⁰⁾ Yasue 등¹¹⁾의 연구에서는 Der f에 대해 A/J, BALB/C 등은 과반응(high response)을 보이고 C57BL6와 C3H/He에서는 중등도 반응(moderate or low response)을 보인다고 하여 연구자마다 다소 상이한 결과를 나타내었다. 이는 사용한 항원(Der p와 Der f)이 다르고 항원 감작 방법의 차이에서 비롯된 것으로 추정된다. C57BL6 마우스만을 사용한 본 연구에서는 종(strain) 간의 비교를 하지 않았지만 Der f에 대하여 만족할 만한 정도의 IgE 반응을 나타내어 실험 전에 우려했던 IgE의 저반응을 나타내지 않았다.
   알레르기 동물 모델을 제작함에 있어서 어떤 방법을 사용할 것인가를 결정하는 것은 중요하다. 가능하면 자연상태와 유사하게 알레르겐에 감작되고 다시 그 항원에 의해 알레르기 비염 반응이 발생하도록 해야 한다. 그러나 집먼지 진드기 항원은 자연상태에서는 미량이 존재하며 감작되는 데에 오랜 시간이 필요하기 때문에 가능한 빠른 시간에 면역반응을 유발시키려면 주사면역(injection immunization) 방법이 흔히 사용된다. 또한 본 실험에서는 pertussis toxin 주사를 병행하였는데 이 방법은 IgE 반응을 증강시킨다는 결과가 이미 다른 동물에서도 확인되었다.¹²⁾ 이렇게 항원을 주사하여 전신 면역을 시킨 후에 가능한 항원이 인체에 노출되는 natural pathway를 유사하게 하기 위해 정기적으로 항원을 비내 점적하여 국소적으로 감작시키려고 시도하였다(A군). 그러나 이 방법에서는 aluminium hydroxide나 Complete Freund's adjuvant 등의 adjuvant를 항원과 함께 섞어 주사하게 되는데 이것이 항원감작에 영향을 미치거나 비특이 염증반응을 일으킬 우려가 있다. 그래서 본 연구에서는 일부의 마우스는 전신감작 없이 Der f 점적만으로 비내 국소감작 만을 시도하였다(B군).
   결과적으로 항원 투여 후 유발된 알레르기 증상과 비점막내 호산구의 침윤 정도는 A군이 B군보다 증가한 수치를 나타내었다(Figs. 2 and 4) 혈청 Der f-특이 IgE 항체 농도도 A군이 B군보다 높은 수치를 나타내어 전신감작과 국소 감작을 동시에 실시한 그룹에서 예상했던 바대로 더 우수한 결과를 나타내었다(Fig. 5).
   그러나 국소 감작만을 시도한 B군에서도 알레르기 증상과 비점막내 호산구의 침윤 정도가 증가하는 것으로 나타나서 국소감작 만으로는 호산구의 증가가 거의 나타나지 않는다고 알려진 난알부민의 경우와 뚜렷하게 구분되었다.¹³⁾ Der f에서는 Der f1과 Der f2라는 24 kD와 14 kD의 분자량을 가진 두가지의 주요 항원이 확인이 되었는데¹⁴⁾ 여기에는 cystein protease와 serine protease 그리고 elastase 등이 포함되어 있어 기도 점막의 투과성의 증가를 유발하고¹⁵⁾ IgE가 관련되지 않은 비반세포의 탈과립을 유발한다고 알려져 있다.¹⁶⁾ 이런 Der f의 성상이 알레르겐으로써 점막 내의 분포하는 항원인지세포인 수지상세포 등에 쉽게 접촉할 수 있게 해준다.¹⁷⁾ 그러나 본 실험에서는 호산구의 조직내 침윤 외에 알레르기 증상과 혈청내 항원 특이 IgE가 증가하지 않았다.
   Der f로 인한 호산구 증가는 나타나지만 혈청내 항원 특이 IgE의 증가가 나타나지 않는 경우는 Kurup 등¹⁸⁾의 연구에서도 보고되었다. 이는 IgE의 생성과 호산구 출현은 같은 Th2 세포에 의해 자극되긴 하지만 서로 다른 싸이토카인인 IL-4와 IL-5의 영향을 각각 받기 때문으로 추정된다. 최근에는 IgE 결핍 마우스에서도 알레르겐에 대한 과민 반응이 나타남을 보고한 경우도 있어 IgE와 관련없이 비반세포의 탈과립을 초래하는 발생기전이 존재함을 시사하기도 하였다.¹⁹⁾ 이런 결과를 종합해 보면 Der f가 국소적으로 유발하는 비점막의 호산구 침윤의 증가는 전신 감작과는 달리 IgE와 관계가 적은 반응일 것으로 사료되었다. 그러므로 반복적인 국소 감작만으로는 전신감작을 하는 것 같은 효과적인 알레르기 반응을 유발하지 못한다고 사료되었다.

결     론

   본 연구에서는 C57BL/6 마우스에 Der f를 adjuvant와 섞어 피하주사하여 전신감작시킨 후 비강내로 Der f를 반복적으로 점적함으로써 집먼지 진드기 알레르기 비염 모델을 제작할 수 있었다. 이렇게 전신감작 후에 비강 국소감작을 시도하는 방법이 비강에 Der f만을 투여하는 방법보다 효과적이라고 사료되었다.

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