서     론

   세포간의 결합(cell-cell adhesion)은 세포의 극성(polarity)과 질서를 확립하고 유지하는데 중요한 역할을 담당한다. 이러한 세포간 결합의 감소는 정상 조직보다는 암종에서 보다 많으며 세포 극성의 소실과 조직학적 구조의 파괴로 인해 조직의 실질을 파괴하게 된다.¹⁾ Cadherin은 세포간의 견고한 결합에 필수적인 Ca²⁺ 의존성의 세포간 결합물질의 일종으로서 여러 세포질 내 물질과 복합체를 이루게 된다.²⁾ E-cadherin은 정상 상피세포에서 표현되는 주된 cadherin molecule로서 세포질 내의 actin cytoskeleton에 연결되기 위해서는 catenin군과의 결합이 필요하다.²⁾³⁾ Catenin 군에는 α-catenin, β-catenin과 plakoglobin 이라고 알려진 γ-catenin이 있으며 β-catenin은 E-cadherin과 α-catenin을 연결시켜 E-cadherin/catenin 복합체를 이루어 세포의 형태를 유지시키는 역할을 한다.²⁾⁴⁾ 따라서 세포막에서의 β-catenin 발현의 감소는 cadherin에 의한 세포간 결합의 장애를 가져오게 되어 종양세포의 기저막 침습 및 전이 등의 악성화를 초래하게 된다. 또한 세포질 내에서 β-catenin은 wnt 경로의 신호변환(signal transduction)의 중요한 인자로 작용한다.⁵⁾ 정상적인 상태에서 β-catenin은 인산화된 상태에서 glycogen synthase kinase 3β(GSK 3β) 효소와 결합되어 APC (adenomatous polyposis coli) 단백에 의해 분해가 된다.⁶⁾⁷⁾ 그러나 wnt에 의해 자극되거나 APC가 불활성화된 상태에서는 β-catenin이 비인산화되어 세포질 내 β-catenin이 증가하게 되어 핵내의 Tcf(T cell effector family)/Lef (leukocyte enhancing factor) 전사인자(transcription factor)와 결합되어 c-myc와 같은 목표 유전자(target gene)를 활성화 시키게 되어 종양의 생성 및 진행을 조절하게 된다.⁸⁾⁹⁾
   타액선 악성종양은 태생학적 기원의 다양성으로 인해 여러 병리조직학적 소견을 보이는 종양으로 구분되며 그 성질 및 예후 또한 각기 다른 것으로 되어있다. 타액선에서 발생하는 선양낭성암종은 발견 전 수 년간의 성장과 빈번한 재발 및 원격전이, 신경주위 침습을 특징으로 한다.¹⁰⁾ 암종은 조직학적 특성에 따라 관상형(tubular type), 사상형(cribriform type), 고형형(solid type)의 세 아형으로 구분되며 종양의 악성도 및 예후에 직접적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.¹¹⁾ 따라서 본 연구는 성양낭성암종의 조직학적 아형 및 신경주위 침습, T 분류, 림프절 전이 여부, 병기 등의 임상적인 특징에 따른 β-catenin의 발현 부위 및 정도를 확인함으로써 종양의 진행 및 악성도 등 생물학적 양태를 이해하고자 한다.

대상과 방법

대  상
   1994년부터 1998년까지 선양낭성암종으로 진단받고 수술적 치료를 받은 총 17명의 환자를 대상으로 하였으며 이전에 방사선 및 화학적요법을 시행받지 않았다. 남자 7명, 여자 10명이며 연령분포는 23세에서 75세로 평균 연령은 47세이었다. 각 환자는 관상형, 사상형, 고형형의 세 군으로 조직학적 아형 분류를 하였고 신경주위 침습유무를 확인하였다(Table 1). T 분류와 림프절 전이 유무 및 병기 구분은 1997년 AJCC(American Joint Committee on Cancer)의 분류에 의해 구분하였다.¹²⁾

방  법

면역조직화학적 검사
   각 환자의 파라핀 포매조직을 5 μm의 두께로 연속절편을 만들어 avidin-biotin-immunoperoxidase complex 방법을 이용하여 면역조직화학적 염색을 시행하였다. Xylene으로 5분간 3회 탈파라핀화 시킨 후 100%, 90%, 80%, 70%의 알코올로 1분씩 처리후 증류수에 함수화 하였다. 10 mM/L citrate buffer(pH 6.0)에 담근 상태에서 123°C, 15분간 autoclave한 후 내인성 과산화효소를 억제하기 위하여 3% 과산화수소수로 15분간 처리하였다. 인산완충식염수(phosphate buffered saline, pH7.6, 이하 PBS로 약함)로 5분간 3회 세척하였고 비특이적 반응을 억제하기 위해서 5% 정상 염소 혈청에서 20분간 배양하였다. PBS로 10분간 3회 세척한 후에 일차항체인 β-catenin mouse 단클론성 항체(1:200, Transduction Laboratories, Lexington, KY)로 실온에서 12시간 이상 반응시켰다. 상온에서 PBS에 10분간 3회 세척하고 2차 항체인 horseradish peroxidase에 결합된 biotinylated antimouse immunoglobin과 streptovidin (Vectastain Elite kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA)에 상온에서 30분간 반응 후 PBS에 세척한 후 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB, Sigma, USA)로 10분간 발색시키고 PBS에 5분간 세척하였다. Hematoxylin으로 대조 염색한 후 탈수 및 permount로 봉입하여 광학현미경하에서 관찰하였다. 음성 대조군은 β-catenin에 대한 일차항체 대신 PBS로 대치시키고 나머지 방법은 같은 방법으로 시행하였다.

β-catenin 분포 분석 및 통계학적 검증
   β-catenin에 대한 면역염색 반응에 따라 세포막에만 표현되는 군, 세포막과 세포질내에 표현되는 군, 핵에까지 표현되는 군, 전혀 세포 염색이 안되는 네 군으로 나누었다. 각 조직 슬라이드는 400배의 고배율 상에서 10군데 이상의 지역에서 1000개 이상의 세포를 세어 각 군의 백분율을 구하여 조직학적 아형 및 신경주위 침습, T 분류, 림프절 전이 유무와 병기에 따라 각각의 변수에 대한 평균 및 표준편차를 구하였다. 환자의 임상적 특징(신경주위 침습, T 분류, 림프절 전이, 병기)과 각 β-catenin 염색 양상과의 통계학적 검증은 Mann-Whitney test로 하였으며 조직학적 아형과의 관계는 Kruskal-Wallis test로 검증하였다.

결     과

조직학적 아형과 β-catenin 반응의 상관관계

   관상형은 주로 세포막에서 β-catenin에 대한 면역반응을 보였고(Fig. 1) 다른 아형과 유의한 차이를 보였다(p<0.05, Table 2). 사상형은 세포막, 세포질과 핵에 대한 반응이 많았으며(p<0.05, Fig. 2, Table 2) 고형형에서는 주로 염색반응이 없었으나(p<0.05, Fig. 3A, Table 2) 2예에서는 세포막, 세포질과 핵에 많이 염색되는 양상을 보였다(Fig. 3B).

신경주위 침습, T분류, 림프절 전이 및 병기와 β-catenin 반응의 상관관계

   신경주위 침습, T 분류, 림프절전이 유무 및 병기에 따른 세포내 각 부위에 따른β-catenin 면역반응에 대한 유의한 차이는 보이지 않았다(Table 3, 4, 5 and 6).

고     찰

   임상적으로 선양낭성암종은 발생 부위의 위치에 따라 또한 병기 등에 따라 다양한 임상적 경과를 겪게 되어 치료 및 예후의 판정이 매우 어렵다. 그러나 세가지 조직학적 아형 중 관상형과 사상형은 비교적 오랜 임상적 경과와 함께 드문 전이와 높은 생존률을 보이나 고형형에서는 빈번한 전이 및 낮은 생존률을 보이는 급격한 경과를 보여 예후를 어느 정도 추측할 수 있는 인자로 알려져 있다.¹¹⁾¹²⁾ 또한 최근의 다양한 암 억제 및 유발인자의 발견으로 인하여 암종의 각 세포의 생물학적 특성을 어느 정도 이해할 수 있어 종양의 전이 및 진행의 예측에 많은 도움을 주고 있다.
   β-catenin은 Drosophila의 발달을 유발하는 wingless 신호 경로의 구성 요소인 Drosophila Armadillo(Arm) 단백과 유사한 구조를 지녀 cadherin과 α-catenin을 연결시켜 세포간 결합을 견고히 하는 역할 이외에 wnt 경로의 신호 전달에 중요한 기능을 담당하고 있다.^4)5)13) 그러나 이 두가지 기능은 여러 직대장암 및 악성흑색종 등의 APC 단백 및 β-catenin변이에 대한 연구에 의해 서로 독자적인 체계로 존재하며 세포질 및 핵 내에서 발현되는 β-catenin은 주로 wnt 경로의 교란에 의한 것으로 이해되고 있다.^14-16) Wnt 단백은 선충류(nematode worms)에서부터 포유류에 이르기까지 발견되는 조직의 발달을 조절하는 cystein-rich secreted 배위자로 주로 세포의 성장, 형태, 운동성과 운명을 결정하며 또한 부적절한 wnt 신호 경로는 종양의 형성에도 관계한다.¹⁷⁾ 여러 구성 요소가 wnt의 세포 내 신호 전달 경로에 관여 하며 특히 자극이 주어지지 않은 정상 상태에서 β-catenin은 GSK-3β라는 효소를 통하여 APC 단백과 결합되어 비활성화되어 있으나 wnt에 의해 자극되면 GSK-3β와 분리되어 자유 형태의 β-catenin으로 세포질 내 존재하여 핵 내의 Tcf/Lef 전사인자와 결합하여 표적 유전자를 활성화 시킨다.^8)9)17) 그러나 β-catenin의 변이 등이 일어난 비정상적인 종양 세포에서는 wnt의 자극이 없이도 β-catenin이 GSK-3β와 분리되어 세포질 및 핵 내의 발현을 관찰할 수 있다.¹⁸⁾¹⁹⁾ 본 연구에서도 특히 사상형에서 세포질 및 핵 내의 β-catenin 발현을 관찰할 수 있었으며 고형형의 일부에서도 관찰되었다. 그러나 관상형 및 대부분의 고형형에서는 거의 관찰되지 않았고 주로 세포막내의 발현이 많고 적음을 보여 아마도 각기 다른 종양의 진행 과정을 겪고 있지 않나 생각된다. 따라서 β-catenin 및 APC 단백에 대한 변이 등의 유전자 결함을 찾는 과정이 추가되어야 한다고 본다. 그러나 관상형과 사상형보다 고형형에서 세포막에서의 β-catenin 발현의 감소는 종양의 악성도에 따라 cadherin/catenin 복합체에 의한 세포간의 결합의 장애를 의미한다고 볼 수 있다. β-catenin의 세포 내 존재하는 자유 형태의 조절에는 APC 단백이나 β-catenin의 변이 이외에도 다양한 요인들이 있으며 특히 β-catenin의 분해에는 ubiquitin-proteasome 분해 경로에 의해 조절된다고 알려져 있어 일정한 종양에서도 병의 경과에 따라 다양한 발현 양상을 보일 것으로 생각된다.²⁰⁾
   본 연구에서는 선양낭성암종의 일반적인 예후와 관계되는 신경주위 침습, T 분류, 림프절 전이 유무 및 병기 등의 임상 양상과는 상관 관계를 찾을 수 없었다. 아마도 조직학적 아형과 일치되지 않는 임상 양상과 제한적인 환자수에 의해 통계적인 유의성을 얻지 못한 이유로 생각되어 향후 더 많은 수의 환자 자료가 필요할 것을 본다. 선양낭성암종은 오랜 유병 기간을 거치기 때문에 예후를 판단하기 위해서는 대개 10년 이상의 추적 관찰을 요하나¹¹⁾ 본 연구에서는 5년내의 환자군을 대상으로 하여 생존률과의 관계를 얻지는 못하였다. 하지만 환자의 예후가 주로 종양의 조직학적 아형과 관계된다고 알려져 있기 때문에 β-catenin에 대한 면역반응의 감소와 생존률의 감소는 어느 정도 일치성을 보이리라 예상할 수 있다. 그러나 세포막 및 세포질에 면역반응을 보이는 예와 전혀 반응이 없는 고형형의 예에 대해서는 예후에 대한 향후 추적 관찰이 필요할 것으로 생각한다.

결     론

   β-catenin에 대한 세포막에서의 면역반응은 관상형에서 사상형 및 고형형 보다 많았으며 사상형에서는 세포질 및 핵내의 면역반응이 많은 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 선양낭성암종에서는 β-catenin의 세포간 결합 기능과 wnt 경로에 의한 종양유전자 발현 유발 기능이 동시에 존재한다고 추정할 수 있어 향후 β-catenin변이 및 여러 가지 wnt 경로의 교란 인자에 대한 연구가 필요할 것으로 생각한다.

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