| A Double Immunohistochemical Study on the Expression of Matrix Metalloproteinase-2 and Type IV Collagen in Squamous Cell Carcinoma of the Oral Cavity and Oropharynx. |
| Geon Choi, Sang Hoon Shin, Jin Ho Choi, Sung Won Chae, Kwang Yoon Jung, Jong Ouck Choi, Hwa Eun Oh |
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Korea University, College of Medicine, Seoul, Korea. geonchoi@kuccnx.korea.ac.kr
2Department of Pathology, Korea University, College of Medicine, Seoul, Korea. |
| 구강 및 구인두 편평 세포암종에서 Type IV Collagen 및 Matrix Metalloproteinase-2의 발현 양상에 대한 이중면역조직화학적 연구 |
| 최 건1 · 신상훈1 · 최진호1 · 채성원1 · 정광윤1 · 최종욱1 · 오화은2 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실1;병리학교실2; |
|
|
|
|
|
| 주제어:
구강 및 구인두 편평세포암종ㆍMMP-2ㆍType IV collagenㆍ전이 예측 인자. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) is produced by tumor cells that specifically cleaves type IV collagen, one of the major constituents of basement membrane. The MMP-2 and type IV collagen have been postulated to have an important role in the invasion and spread of malignant tumors. However, little has been reported about expression of MMP-2 and type IV collagen in primary tumors and metastatic lymph nodes of oral cavity and oropharynx simultaneously. So we investigated that MMP-2 and type IV collagen can be used as the prognostic indicators of metastasis in squamous cell carcinoma of oral cavity and oropharynx.
MATERIALS AND METHODS:
Double immunohistochemistry was used to detect MMP-2 and type IV collagen in 32 primary tumors (14 cases had metastatic nodes and 18 cases had no metastatic node) of surgically treated squamous cell carcinoma of the oral cavity and oropharynx. The findings were compared to clinical findings of each cases.
RESULTS:
The immunoreactivity of MMP-2 increased significantly as more destructive patterns of basement membrane components in primary tumor (p=0.019) than metastatic lymph nodes. The cases with cervical metastasis showed more destructive patterns than cases with absence of cervical metastasis in primary tumor (p=0.003), but expression of MMP-2 had no correlation with presence or absence of cervical metastasis. The cases with diffuse invasion showed more destructive pattern than cases with any other patterns in primary tumor. However, expression of MMP-2 had no correlation with invasion mode of primary tumor. In metastatic lymph node, neither of them had no correlation with invasion mode. No statistical correlations in expression of MMP-2 and type IV collagen were detected between primary tumor and metastatic lymph nodes.
CONCLUSION:
The expression patterns of MMP-2 and type IV collagen in oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma can be useful in predicting cervical metastasis. |
| Keywords:
Oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinomaㆍMMP-2ㆍType IV collagenㆍCervical metastasis |
서론
구강 및 구인두 편평세포암종에서 종양의 침습과 전이는 환자의 예후에 중요한 영향을 미치고,1) 이러한 종양의 침습과 전이는 종양 세포의 기저막 부착과 종양 세포에서 분비하는 효소에 의한 기저막의 파괴를 통한 종양세포의 이동으로 인해 발생된다.2)3) 종양 세포에서 분비하여 세포기질의 단백질을 분해하는 효소는 serine proteinase, cysteine proteinase, matrix metalloproteinase(MMP) 등이 있고 이중 MMP 계열의 하나인 MMP-2(gelatinase 72 kd)는 기저막의 주요성분인 type IV collagen을 분해하는 type IV collagenase로 알려져 있다.4-6)
구강 및 구인두 편평세포암종의 원발병소와 전이 림프절에서 MMP-2의 발현양상에 관한 연구1)6)는 있었으나 MMP-2의 발현과 이에 따른 기저막의 분포양상의 상관성, 조직병리학적 분화도, 임상적 병기와의 관계 등의 임상 및 조직병리학적 비교연구가 미비하다. 이에 구강 및 구인두 편평세포암종의 원발암과 전이림프절에서 type IV collagen 및 MMP-2의 관련 항원을 이용하여 이중면역조직화학적 검사를 시행하여 이들의 발현양상을 관찰하고 임상적으로 비교 분석하여 전이여부의 예측인자로 유용한지를 알아보고자 본 연구를 시행하였다.
대상 및 방법
대상
1993년 1월부터 1997년 12월까지 5년간 구강 및 구인두의 편평세포암종으로 수술을 시행 받은 환자 중 술후 조직병리학적으로 경부 림프전이가 있었던 14예와 전이가 없었던 18예를 대상으로 하였다. 경부림프절에 전이가 있었던 예에서는 설암이 6예, 설기부암이 1예, 편도암이 4예, 구강저암이 1예, 구후삼각암이 1예, 경구개암이 1예이었고, 전이가 없었던 예에서는 설암이 9예, 편도암이 4예, 구후삼각암이 1예, 구강저암이 3예, 협부암이 1예이었다.
방법
재료
조직 표본 재료는 헤마톡실린-에오신 염색조직을 재검사하여 원발암은 중심부로 판단된 조직과 전이림프절 중 보존상태가 양호한 조직을 선택하였다. MMP-2 발현의 양성 대조는 각 유전자 산물에 양성으로 확인된 자궁경부 편평세포암종 조직 2예를, type IV collagen의 양성 대조는 적출 조직에 포함된 정상 상피조직과 혈관벽의 기저막 염색상태를 내부대조로 이용하였다. 음성 대조는 3예의 종양에서 MMP-2, type IV collagen 각각의 일차 항체를 처리하지 않은 조직절편을 사용하였다.
이중 면역조직화학적 염색
10% 중성 포르말린에 고정하여 파라핀에 포매시킨 조직을 4 μm 두께의 절편으로 만들어 양전하를 띤 슬라이드(ProbeOn Plus Microscope Slides, FisherBiotech, USA)에 부착하고 60℃ 신전기로 건조시킨 후 xylene에 탈파라핀 하고 100%, 90%, 80%, 70% 계열 에탄올 및 증류수에 담가 함수 처리하였다. 항원이 잘 노출되도록 pH 6.0 citric acid 용액에 담근 후 microwave oven에서 121℃로 15분간 가열하고 15분 정도 상온에서 식혀 인산완충액에서 중화하였다. 알카리성 포스파타제 억제는 0.1 M tris-HCl 완충액에 용해한 1% levamisole로 10분간 처리하였고 수세 후 비특이적인 단백질 결합을 막기위해 인산완충액에 용해된 10% 말혈청으로 30분간 반응시켰다. 인산완충액으로 100배 희석시킨 단클론성(monoclonal) MMP-2항체(Ab-4, monoclonal mouse IgG, Oncogene Research Products, Calbiochem, USA)에 4℃에서 12시간 반응시켰다. 수세후 ABC(Avidin-biotin-peroxidase complex)법으로 biotin이 결합된 이차항체를 30분간 실온에서 반응시키고 인산완충액으로 수세 후 알카라인 포스파타제가 배합된 streptavidin을 가하여 30분간 반응시켰다. 수세 후 red substrate로 5분간 발색 후 수세하였고 인산완충액에서 15 분간 중화시킨 후 조직의 내인성 과산화효소억제는 0.3% 메탄올-과산화수소 용액으로 20분간 처리하였고 pH 7.4 의 인산완충액에 희석시킨 0.1% pepsin으로 37℃에서 5분간 처리하였고 수세 후 10% 염소 정상 혈청으로 30분간 반응시켰다. 인산완충액에 30배 희석된 다클론성(polyclonal) collagen type IV 항체(polyclonal rabbit IgG, Biogenesis, USA)와 실온에서 45분간 반응시켰다. 수세 후 시료에 biotin이 결합된 이차항체를 가한 후 40분간 실온에서 반응시키고, 재차 수세하여 streptoavidin-peroxidase(Histostatin TM SP kit, Zymed Lab. Inc., USA)를 가해 30분간 반응시킨 다음 인산완충액에서 수세하였다. 5분간 diaminobenzidine으로 발색시키고 세포핵은 해리스-헤마톡실린으로 대조 염색하여 70%, 80%, 90%, 100% 계열 에탄올로 탈수 후 xylene으로 세척하고 permount로 봉입하여 관찰하였다.
면역조직학적 염색의 평가
MMP-2의 발현정도는 Autio-Harmainen 등7)의 변형된 분류를 사용하였고 광학현미경으로 관찰하여 염색이 안된 경우는(-)로, 주변부에 비해 약간의 반응 증가가 있거나 5 % 미만의 세포만이 염색된 경우를(±)로, 5∼50% 사이의 세포가 염색되거나 쉽게 증가된 염색상을 발견할 수 있을 경우를 (＋)로, 50% 이상의 세포가 염색되거나 강한 양성반응을 보일 때를 (＋＋)로 정하였다. Type IV collagen의 분포 양상은 Havenith등8)의 판정 방법에 준해 종양조직과 세포외 간질 사이에 분포된 양상으로 구분하였고, 75% 이상 분포된 경우를 보존형(preservative pattern), 25∼75 %인 경우는 중간형(intermediate pattern), 25% 이하인 예는 파괴형(destructive pattern)으로 판정하였다.
임상적 병기, 조직병리학적 분화도 및 침습형태의 판정
대상 예의 임상적 병기는 1997년 미국암협회(AJCC) 기준에 따라 분류하였고, 조직병리학적 분화도는 분화도가 아주 좋은 경우 grade1(G1), 중등도 분화도는 grade2(G2), 분화도가 나쁜 경우 grade3(G3)로 판정하였다. 종양의 침습형태는 종양의 침습이 심한 부위에서 세포외 간질로 침습하는 형태를 잘 관찰하여 type Ⅰ은 경계가 잘 지어진(well defined) 형태를 보인 예, type Ⅱ는 삭상(cord-like)으로 침습하는 형태를 보인 예, type Ⅲ는 산재성침습(diffuse invasion) 형태를 보인 예로 분류하였다.
통계학적 검증
통계학적 처리는 Sigma-stat 통계 프로그램을 이용하여 Chi square test, Fisher's exact test, Spearman correlation test를 시행하고 유의수준은 0.05 미만으로 정하였다.
결과
MMP-2는 암소내에서 관찰되었으며 종양세포의 세포질에 적색으로 염색되었고 type IV collagen은 혈관벽의 기저막 및 종양조직과 세포외간질 사이에 암갈색으로 염색되었다(Figs. 1, 2 and 3).
1) 원발병소와 전이림프절에서 MMP-2의 발현과 type IV collagen의 분포양상 원발병소에서 MMP-2의 발현이 높을 수록 type IV collagen의 분포양상은 파괴형이 많았다(p＝0.019)(Table 1, Fig. 1A). 전이 림프절에서는 MMP-2 발현양상에 따른 type IV collagen의 분포양상의 차이는 없었다(p>0.05)(Table 2).
2) 림프절 전이 여부에 따른 MMP-2의 발현과 type IV collagen의 분포양상 원발병소에서 MMP-2의 발현 양상에 따른 림프전이의 차이는 없었다(p＝0.119)(Table 3). Type IV collagen의 분포양상에 따라 파괴형에서 보존형보다 림프전이가 많았다(p＝0.003)(Table 4).
3) 종양의 침습 형태에 따른 MMP-2의 발현과 type IV collagen의 분포양상 종양의 기질로의 침습의 정도가 심할수록 원발병소에서 type IV collagen의 분포양상이 파괴형이 많았으나(p＝0.009)(Table 5, Figs. 1A and 3A) MMP-2의 발현 정도는 종양의 침습정도와 유의한 상관관계가 없었다(p＝0.064).
4) 종양의 조직학적 분화도에 따른 MMP-2의 발현과 type IV collagen의 분포 양상 원발종양의 조직학적 분화도에 따른 MMP-2의 발현 양상 및 type IV collagen의 분포 양상의 유의한 차이는 없었다(p>0.05).
5) 원발종양의 병기와 MMP-2의 발현과 type IV collagen의 분포양상 종양의 병기가 진행될수록 원발병소에서 MMP-2의 발현이 증가하였고(p＝0.018), type IV collagen의 분포양상이 파괴형이 많았다(p＝0.007)(Table 6 and 7, Figs. 1A and 3A).
6) 림프절 전이가 있었던 예의 원발병소와 전이림프절의 MMP-2의 발현과 type IV collagen의 분포양상 림프절 전이가 있었던 예의 원발병소와 전이 림프절에서 type IV collagen의 분포양상은 서로 유의한 상관관계가 없었고(p>0.05, MMP-2의 발현 양상도 원발병소와 전이 림프절에서 서로 유의한 상관관계가 없었다(p>0.05).
고찰
Liotta등2)3)은 기저막의 중요성분인 type IV collagen등이 종양세포에서 분비하는 type IV collagenase에 의하여 분해되어 기저막이 파괴되며 이러한 과정이 종양침습의 첫 단계라고 하였다. Type IV collagenase에는 MMP 계열의 일원으로 MMP-2(gelatinase 72 kd), MMP-9(gelatinase 92 kd)등으로 구성되며, type Ⅴ collagen과 elastin을 함께 분해시켜 기저막 파괴의 중요한 효소로 알려져 있다.4)6) Kusukawa등1)은 구강 및 구인두 편평세포암종에서 원발병소의 MMP-2의 발현이 증가함에 따라 종양 침윤 및 전이가 증가함을 면역조직화학적으로 관찰하였고, Hirota등9)은 구강암에서 type IV collagen으로 검색한 기저막 성분의 분포 양상이 원발병소의 병기, 침습 형태, 경부전이 여부와 관계가 있다고 하였다. Monteagudo등10)은 유방암의 전이 림프절에서도 MMP-2의 발현 양상이 증가되어 있음을 보고하였고, Bonkhoff 등11)은 전립선암에서 원발병소와 유사한 양상으로 전이림프절에 분포한 종양세포주위의 기저막을 관찰하였으나, 원발병소와 전이 림프절에서 MMP-2와 type IV collagen을 함께 관찰 비교한 경우는 없었다.
저자들의 연구에서 원발병소에서는 타 보고1)12)와 같이 림프절 전이가 있는 경우 MMP-2의 발현이 증가되었고, 구강암, 후두암9)13)14)의 결과와 같이 type IV collagen의 분포양상은 파괴형이 유의하게 증가하였으며 MMP-2의 발현이 증가될수록 type IV collagen의 파괴가 증가하는 것으로 보아 서로는 밀접한 관계에 있음을 알 수 있었다.
종양 침습의 양상은 MMP-2의 발현이 많은 예가 침습이 많았으나 통계적 유의성은 없었고 기저막성분 중 type IV collagen 분포양상과 침습양상과는 밀접한 관계에 있음을 알 수 있었다. 이는 Kusukawa등1)의 종양 침습 정도가 심할수록 MMP-2의 발현이 증가하였다는 결과, Visser등15)의 기저막성분의 양상을 검색하는 것이 종양의 침습 정도를 판단하는 진단적 가치가 있다는 보고 등과 일치 하는 결과로 종양의 침습이 심할수록 MMP-2의 발현이 증가하며 따라서 type IV collagen의 파괴도가 증가한다고 생각할 수 있다. 본 실험에서 동일 조직내에서 MMP-2의 발현이 증가된 부분이 type IV collagen의 파괴가 증가되어 있는 것이 관찰되어 이러한 사실을 입증하는 소견으로 생각된다.
원발병소의 병기와 MMP-2 발현의 상관성은 Kusukawa등1), Charous등6) 이나 Kim 등12)의 보고와는 달리 본 연구에서는 통계학적으로 유의한 상관관계(p＝0.018)가 있었다. 원발병소의 병기와 type IV collagen의 파괴 정도와는 Kumagai등16)이나 Choi 등14)의 보고와 달리 통계적으로 유의한 상관관계가 있었다. 이와 같은 결과의 차이는 Choi 등14)의 연구에서는 T3, T4의 경우만 비교하였으나 본 연구에서는 T1 부터 T4까지 고른 분포를 보인 대상을 비교하였기 때문으로 생각되며 본 연구의 결과가 더 신뢰성이 있다고 생각된다. 그러므로 원발병소의 병기가 증가할수록 MMP-2의 발현이 증가하며 type IV collagen의 파괴가 증가한다고 볼 수 있다.
원발병소에서 종양의 조직병리학적 분화도와 MMP-2 및 type IV collagen의 분포양상과의 관계는 타 결과들1)6)12)17)과 같이 유의성이 없었다. 그러나 type IV collagen의 분포양상에서 유의있는 결과를 얻었다는 보고13)16)도 있다.
전이가 있었던 예의 전이림프절에서의 MMP-2의 발현정도 및 기저막의 분포양상과 원발종양의 병기, 침습, 병리조직학적 분화도의 비교는 Kusukawa등1)의 결과와 같이 큰 유의성이 없었다. 그러나 본 연구의 대상이 14예로 대상의 수가 불충분하다고 생각되어 향후 이에 대한 연구가 더 필요하다고 생각된다.
Kobayashi등18)은 햄스터에 편평세포암종 O-1N을 주입하여 림프절 전이를 유발한 후 type IV collagen으로 기저막을 관찰한 연구에서 종양세포의 림프절 전이에 있어 기저막의 소실은 필수적 요소라고 보고한 반면, Bonkhoff 등11)은 전립선암의 전이림프절에서 종양 변연의 기저막 성분을 관찰하였고, Albrechtsen등19)은 전이성 유방암종의 전이림프절에서 종양 변연의 기저막을 laminin을 이용하여 관찰하였다고 보고하였다. 본 연구에서는 전이림프절에서 type IV collagen의 분포양상이 보존형 1예, 중간형 10예, 파괴형 3예가 관찰되었는데 이는 Visser등15)이 종양 변연의 기저막 성분이 종양세포의 세포질에서 생성되었을 가능성을 제시한 것을 뒷받침하는 결과라고 하겠다.
전이가 있었던 예에서 원발병소에서 전이림프절로의 MMP-2의 발현양상 및 기저막의 분포양상과의 상관성을 밝히고자 하였으나 모두 유의성이 없었다. 이는 원발병소와 전이 림프절의 특성이 일치하지는 않는다는 것을 나타내는 소견으로 생각된다.
결론
구강 및 구인두 편평세포암종에서 전이 림프절이 있는 경우, 원발종양의 병기 증가 및 침습이 심할수록 MMP-2의 발현이 증가되고 기저막의 type IV collagen 분포 양상이 파괴되는 것을 보여주어 MMP-2및 type IV collagen이 전이여부를 예측하는 인자로 유용성이 있을 것으로 생각된다.
REFERENCES
1) Kusukawa J, Sasaguri Y, Shima I, Kameyama T, Morimatsu M. Expression of matrix metalloproteinase-2 related to lymph node metastasis of oral squamous cell carcinoma. Am J Clin Pathol 1993;99:18-23.
2) Liotta LA, Rao CN, Barsky SH. Tumor invasion and the extracellular matrix. Lab Invest 1983;49:636-49.
3) Liotta LA. Tumor invasion and metastasis. Role of the extracellular matrix. Cancer Res 1986;46:1-7.
4) Ennis BW, Matrisian LM. Matrix degrading metalloproteinases. J Neurol Oncol 1994;18:105-9.
5) Mignatti P, Rifkin DB. Biology and biochemistry of proteinases in tumor invasion. Physiol Rev 1993;73:161-95.
6) Charous SJ, Stricklin GP, Nanney LB, Netterville JL, Burkey BB. Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases in head and neck squamous cell carcinoma. Ann Otol Rhinol Laryngol 1997;106:271-8.
7) Autio-Harmainen H, Karttunen T, Hurskainen T, Hoyhtya M, Kauppila A, Tryggvason K. Expression of 72 kilodalton type IV collagenase (gelatinase A) in benign and malignant ovarian tumors. Lab Invest 1993;69:312-21.
8) Havenith MG, Arends JW, Simon R. Type IV collagen immunoreactivity in colorectal cancer prognotic value of basement membrane deposition. Cancer 1988;62:2207-11.
9) Hirota J, Yoneda K, Osaki T. Basement membrane type IV collagen in oral squamous cell carcinoma. Head Neck 1990;12:400-5.
10) Monteagudo C, Merino MJ, Sanjuan J, Liotta LA, William G, Stevenson S. Immunohistochemical distribution of type IV collagenase. Am J Pathol 1990;136:585-92.
11) Bonkhoff H, Wernert N, Dhom G, Remberger K. Distribution of basement membranes in primary and metastatic carcinomas of the prostate. Hum Pathol 1992;23:934-9.
12) Kim SH, Cho JS, Lim SC, Baik KJ, Park CS. Expression of Matrix Metalloproteinase-2 in the Cervical Lymph Node Metastasis of the Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Korean J Otolaryngol 1998;41:1041-6.
13) Cho JS, Kim JS, Shim WJ, Kim SH, Lim SC, Lee CW, et al. A study on the Type IV Collagen Expression in the Basement Membrane surrounding the Cancer Nest (Cancer Nest Membrane) and Cervical Lymph Node Metastasis of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Korean J Otolaryngol 1997;40:1554-62.
14) Choi G, Choi JO, Hwang SJ, Yoo HK. A study on distribution of lamin-in and type IV collagen in advanced squamous cell carcioma of the larynx. Korea University Med J 1992;29:313-24.
15) Visser R, Van Der Be JMH, Havenith MG, Cleutjens JPM, Bosman FT. Immunocytochemical detection of basement membrane antigens in the histopathological evaluation of laryngeal dysplasia and neoplasia. Histopathol 1986;10:171-80.
16) Kumagai S, Kojima S, Imai K, Nakagawa K, Yamamoto E, Kawahara E, et al. Immunohistologic distribution of basement membrane in oral squamous cell carcinoma. Head Neck 1994;16:51-7.
17) Kim JN, Chung SM, Min JH, Kim SS, Kim MY. An immunohistochemical study on the expression of matrix metalloproteinase-2, tissue inhibitor of metalloproteinase-2 and angiogenesis in human laryngeal squamous cell carcinoma. Korean J Otolaryngol 1997;40:671-81.
18) Kobayashi Y, Nakajima T, Saku T. Loss of basement membranes in the invading front of O-1N, hamster squamous cell carcinoma with high potential of lymph node metastasis. An immunohistochemical study for laminin and type IV collagen. Pathol Int 1995;45:327-34.
19) Albrechtsen R, Nielsen M, Wewer U, Engvall E, Ruoslahti E. Basement membrane changes in breast cancer detected by immunohistochemical staining for laminin. Cancer Res 1981;41:5076-81.
|
|
PDF Links
Full text via DOI 
Download Citation 
