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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(8): 950-954. |
| Expression of Ki-67 and Topoisomerase IIa in Human Middle Ear Cholesteatoma Epithelium. |
| Han Kyu Suh, Eun Soo Lee, Jin Ho Choi, Byung Sun Jun, Jae Jun Song, Hyun Ho Lim, Soon Jae Hwang |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. |
| 진주종 상피에서 Ki-67과 Topoisomerase IIα의 발현 |
| 서한규 · 이은수 · 최진호 · 전병선 · 송재준 · 임현호 · 황순재 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| 주제어:
Ki-67ㆍTopoisomerase IIαㆍ진주종. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Cholesteatoma is a destructive lesion of the middle ear or mastoid process. The development of human cholesteatoma is due to the altered control of cellular proliferation in part, which tilts the balance toward the aggressive, invasive growth of squamous epithelium within the middle ear. Many efforts were performed to prove overproliferative characteristics of cholesteatoma using various proliferation markers.
Nonetheless, trigger site of overproliferation within the overgrowing epithelium of cholesteatoma is still ill defined.
MATERIALS AND METHODS:
In this study, we used the monoclonal antibody Ki-67 and Topoisomerase II, a marker of active proliferation, on frozen sections obtained from 12 cholesteatoma samples and observed expression of these markers in three different regions, from normal meatal skin, transitional zone and cholesteatoma sac.
RESULTS:
The results were interpreted on the basis of nuclear staining and percentage of positively stained cells (labeling index). We found that labeling indices of cholesteatoma and transitional zone were significantly increased compared with that of normal meatal skin.
CONCLUSION:
This result suggested that initiating of overproliliferation of cholesteatoma epithelium started from the transitional zone. |
| Keywords:
Ki-67ㆍTopoisomerase IIalphaㆍCholesteatomaㆍTransitional zone |
서론
성장 특성이 변화된 편평상피 조직이 중이강내로 침범하여 발생하는 질환인 중이진주종은 정상 상피세포와는 다른 과증식력(hyperproliferative activity)을 가지고 있다.1-3) 따라서 진주종의 발생원인이나 병리기전은 상피세포의 이주(migration), 증식(proliferation) 그리고 각질세포(keratinocyte)의 분화와 밀접한 관계를 가지고 있으며3)4) 많은 요소들이 이 과정에 관여하리라 여겨진다. 진주종 상피의 과증식력을 증명하기 위하여 세포증식을 나타내는 proliferation cell nuclear antigen(PCNA), Ki-67 같은 표지자들이 주로 이용되어 왔다.1)4) 그러나 진주종 상피에서 PCNA, Ki-67 같은 과증식의 표지자들의 발현이 증가하지만 세포증식을 억제하는 p53 단백이나 세포고사(apoptosis)가 정상상피보다 많이 관찰된다는 사실로3-5) 보아 종양세포와는 달리 무제한 과증식되지 않고 어느 선에서 증식이 중단된다고 생각된다. 따라서 PCNA나 Ki-67같이 세포분열의 전 과정에서 발현되는 표지자의 관찰만으로 정확한 등식력이나 과증식이 유발되는 원인을 찾을 수 없다고 생각되어 본 실험에서는 진주종 상피를 정상 상피부, 진주종으로 이행되는 부분, 그리고 진주종 상피 세 부분으로 나누어 Ki-67과 함께 세포분열 주기 중 실제로 세포분열이 일어나는 S, G2/M phase에 특징적으로 나타나는 Topoisomerase IIα의 발현을 비교 관찰하여 진주종 상피에서 과증식과 상피층으로 이주가 유발되는 부위를 알아 보고자 하였다.
재료 및 방법
실험 재료
실험 재료는 고려대학교 구로병원 이비인후과에서 진주종성 중이염으로 수술을 받은 환자 중 수술시 외이도 상피가 상고실로 침범되는 것이 확인된 12예의 진주종 조직을 실험재료로 사용하였다. 진주종 상피는 다시 수술 현미경 시야에서 구분하여 정상 외이도 상피와 외이도 상피가 상고실로 함몰되는 이행부, 그리고 이행부 상피에서 5 mm 이상 떨어진 진주종낭(cholesteatoma sac) 부위의 상피 등 세 부분으로 구분하여 검체를 얻었다. 떼어낸 조직은 즉시 액화질소 분무기를 이용하여 급속 냉동시킨 뒤 면역염색에 사용할 때 까지 -70℃의 냉동고에 보관하였다.
실험방법
조직표본제작
수술시 얻은 각각의 조직을 Tissue-Tek(r)<0A397>(Miles laboratories, USA)에 넣고 액화질소 분무기로 동결시킨 뒤 냉동절편기(Reichert-Jung, Germany)로 10 μm 두께의 연속 동결절편을 얻어 슬라이드(ProbeOn Plus Microscope slide, Fisher Biotech(r)<0A397>, USA)에 부착시켜 조직표본을 제작하였다.
면역조직화학적 염색
동결 절편은 0.2 M 인산완충식염수(PBS)로 5분간 3회 씻은 뒤 아세톤으로 3분간 2회 고정하고, 내인성 과산화효소 활성을 억제시키고 일차 마우스 단일클론 항체의 비특이적 결합을 감소시키기 위하여 3% H2O2-methanol용액에 5분간 처리하고 0.2 M PBS로 5분간 3회 수세하고 45℃에 5분간 건조 시킨 뒤 1：50으로 희석된 Ki-67에 대한 단클론 항체(Clone 7B11, Zymed Lab Inc, USA)와 1：100으로 희석한 Topoisomerase IIα 단클론 항체(Clone J112, Neomarker, USA)를 부착시켜 4℃에서 하룻밤 동안 처치하였다. 일차항체로 처리된 동결절편은 인산 PBS로 수세한 뒤 이차항체(HistostatinTM SP Kit, Zymed Lab Inc, USA)로 20분간 처리하고 Streptoavidin-peroxidase(HistostatinTM SP Kit, Zymed Lab Inc, USA)에 7분간 반응시킨 뒤 물로 씻었다. 발색반응을 위하여 Ki-67항체는 DAB(diaminobenzidine, Sigma. USA)로 처리하였고 AEC(3-Amino-9-ethyl-carbazol, Zymed Lab Inc, USA)를 사용하여 Topoisomerase IIα의 발현을 관찰하였다. 염색된 세포를 구분하기 위하여 조직표본은 1% Harris-hematoxylin으로 대조염색을 시행한 뒤 탈수 및 봉합과정을 거쳐 광학 현미경(Olympus BH-2, Japan)으로 발현된 세포를 관찰하였다.
표지지수(Labeling Index)의 산출과 분석
표시지수는 각각의 슬라이드를 400배 현미경 시야에서 500개의 상피세포를 세고 이 중 Ki-67과 Topoisomerase IIα에 양성으로, 뚜렷하게 갈색이나 적색의 과립형으로, 염색된 세포의 수를 백분율로 표시하여 산출하였다.
정상 외이도 피부와 이행부 그리고 중이 진주종에서 표지지수의 차이를 Sigma Plot program의 unpaired t-test를 사용하여 통계학적 유의성을 분석하였으며 이때 유의수준을 95%로 정하였다.
결과
면역조직화학염색 결과
정상 외이도 상피는 Ki-67에 양성반응을 보이는 세포가 기저세포층(basal layer)에 국한되어 나타났으나(Fig. 1) 이행부 상피는 양성반응을 보이는 세포가 기저층 상부와 극상세포층에서 관찰되었다(Fig. 2). 진주종 상피에서 Ki-67의 발현은 기저층과 상부에서 염색반응이 강하게 관찰되었으며 상피 전층에 걸쳐 양성반응을 보이는 세포가 관찰되었다(Table 1, Fig. 3).
Topoisomerase IIα 염색 결과 정상 외이도 상피는 주로 기저층에서 양성으로 발현되는 세포가 관찰되었으며 매우 드물게 기저층의 상부에서도 관찰되는 경우가 있었다. 그러나 발현되는 세포의 표지지수가 Ki-67 양성세포에 비하여 유의하게 감소되어 있었다(p<0.05, Table 2). 이러한 발현 양상이 이행부상피와 진주종상피로 진행되면서 발현되는 세포수와 표지지수가 증가하였고 상피층 쪽으로 여러 층에 걸쳐 나타나는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 5). 진주종상피에서는 Topoisomerase IIα 염색이 기저층에 집중적으로 발현되었고 상피층 쪽으로 여러층에서 관찰되었다(Fig. 6).
정상 외이도상피에서 이행부상피로 갈수록 Ki-67과 Topoisomerase IIα의 발현이 증가하였고 염색되는 상피층의 수도 증가되어 나타났다.
Ki-67 양성 세포는 이행부상피 및 진주종상피에서 기저층 상부를 포함하여 여러 층에서 관찰되었고 모든 부위에서 Ki-67에 양성으로 염색된 세포의 수가 Topoisomerase IIα 양성 세포수 보다 많이 관찰되었다(Table 1).
표시지수(Labeling index) 산출 결과
정상 외이도상피의 Ki-67과 Topoisomerase IIα의 표지지수는 각각 7.15±1.56%, 5.20±1.32%였고 이행부상피에서의 각각 13.7±2.87%, 9.75±2.53%, 진주종상피에서는 20.25±4.82%, 14.2±3.07% 였다. 이행부 상피 및 중이 진주종상피의 Ki-67과 Topoisomerase IIα의 표지지수는 정상 외이도상피의 표지지수 보다 통계적으로 의미 있게 증가하였다(p<0.05, Table 2).
고안
중이진주종의 특징인 각질세포 과증식 원인은 아직까지 확실히 밝혀져 있지 않으나 증식 조절유전자의 기능 이상이나3) 간질층에 침윤된 염증세포에서 분비되는 면역물질에 의하여 유발된다고 여겨지고 있다.7-10) 진주종 상피의 과증식을 측정하기 위하여 Ki-67,4)6) proliferating cell nuclear antigen(PCNA), 1) epidermal growth factor receptor(EGF-R),8) granulocyte-macrophage colony stimulating factor(GM-CSF),7) transforming growth factora11) 같은 증식표지자들이 이용되어 왔다. 그러나 상기한 표지자들은 휴지기 이외의 모든 세포주기(cell cycle) 기간에 발현되는 표지자여서 실제 진주종 상피의 증식이 일어나는 부위를 정확히 관찰할 수 없는 단점이 있다. Albino 등3)은 진주종 상피에서 Ki-67의 발현이 기저층 상부의 여러 층에 걸쳐 관찰되었으나 세포증식을 억제하는 p53이 정상 상피에 비하여 진주종 상피에서 유의하게 증가되었다는 보고와, 세포고사 또한 많이 나타났다는 Kojima 등6)의 실험결과로 보아 세포주기의 전과정에 발현되는 증식표지자의 관찰만으로는 진주종 상피의 과증식을 정확히 판단하기 어려울 것으로 생각된다.
실험에 사용된 Topoisomerase IIa는 17번 염색체에 위치하는 유전자에서 만들어진 효소로 세포분열시 핵산의 이중나선 구조를 일시적으로 분리하여 염색체를 분리하고 농축시키는 역할을 하며 세포주기 중 실제로 세포분열이 일어나는 시기인 S-G2/M기에 특이적으로 나타나는 특성이 있다.12-14)
실험 결과, Ki-67의 발현은 다른 증식표지자를 사용했던 실험 결과와 유사한 위치에서 양성으로 나타났으나 Topoisomerase IIa의 발현은 Ki-67 양성 반응을 보이는 부위에서 관찰되었지만 양성으로 염색되는 세포의 수가 매우 적었으며 기저층 쪽으로 치우쳐 있었다. 이는 기저층에서 보였던 과증식이 상부로 가면서 실제로 증식하는 세포가 감소한다는 것을 의미하는 것으로 해석되었다.
Colombell 등15)에 의하면 전립선에서 호르몬에 의한 세포고사의 경우 세포주기에 진입한 후 중간단계 즉 S기 이후에 세포주기의 단절로 인하여 세포고사가 일어나며 이 과정에서 p53이 관여한다고 하였다. 본 실험의 결과에서도 S기에 특이적으로 나타나는 Topoisomerase IIα의 발현이 상부기저층(suprabasal layer)에서 많이 관찰되었던 점으로 보아 진주종상피에서는 세포의 과증식이 상부기저층에서 멈추면서 증식되었던 세포가 상피로 이주하여 각질화 과정을 거치는 것으로 생각되었으며 이는 Albino 등 3)의 보고에서 진주종상피의 과립층에서 p53의 분포가 관찰되었다는 결과와 상응하는 것이라 여겨진다.
또한 Ki-67이나 Topoisomerase IIα 모두 정상 외이도상피에서 진주종낭으로 이행되는 이행부상피 조직에서부터 양성반응을 보이는 세포의 수가 기저층에서 증가하고 기저층 상부에 발현되었던 결과로 보아 진주종상피의 과증식은 이행부 기저층에서 과증식이 유발되어 기저상부층으로 이주하는 것으로 생각되었다.
Mayot 등4)의 관찰 결과 진주종 상피가 간질층내로 유두상 내향증식(papilllary ingrowth)하는 부위에서 많은 염증세포의 침윤이 관찰되었고 Ki-67에 양성반응을 보이는 세포가 증가하였다는 보고와 이 부위에서 염증반응을 매개하는 세포간 유착분자의 발현이 증가되어 있고,16) 체외 세포배양(explant culture) 결과에서도 진주종상피가 고막에서부터 함몰이 시작되는 부위에서 과증식력을 보이는 세포가 증가된다는 Cheshir 등17)의 보고로 미루어 보아 진주종의 이행부상피에서 과증식이 된 세포들이 증식되고 이주를 시작하는 것으로 생각되었다.
저자들의 관찰 결과에서도 Fig. 7에서처럼 유두상의 내향증식은 주로 이행부 상피에서 관찰되었으며 Ki-67과 Topoisomerase 등의 과증식의 표지자가 정상 상피에서 보다 의미있게 증가되어 있고 기저층 보다 상방으로 이주하는 것이 관찰된 사실은 상기한 결과들을 뒷받침하는 실험결과라 생각되었다.
진주종 상피에서 Topoisomerase IIα에 양성 반응을 보이는 세포의 발현은 현재 세포분열 중인 세포가 있다는 증식표지자로서의 의미 외에 양성 반응을 보이는 세포가 여러 약제의 치료 표적이 될 수 있다는 중요한 의미를 갖는다. Topoisomerase IIα는 novobiocin, nalidixic acid, doxorubicin18) 등의 표적이 되는 단백으로 알려져 있고 Bohr 등19)의 보고에 의하면 진주종과 유사하게 상피세포의 과증식으로 발생하는 질환인 건선(psoriasis)에서 Topoisomerase IIα에 길항 작용을 갖는 novobiocin을 이용하여 좋은 성적을 얻었다고 보고하고 있다.
결론
중이 진주종상피에서 각질세포의 증식능력을 알아보고 상피진주종에서 과증식이 시작되는 부위를 알아보고자 수술시 체취한 검체를 정상 외이도 조직, 이행부조직, 그리고 진주종 상피 세부분으로 나누어 증식표지자인 KI-67과 Topoisomerase IIα 항원에 대한 면역조직 화학적 염색을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
Ki-67과 Topoisomerase IIα에 양성반응을 보이는 세포가 정상 외이도 상피에서는 기저층에 국한되어 간헐적으로 관찰되었으나 이행부와 진주종 상피에서는 발현되는 세포의 수가 증가하였고 기저층보다 상층에서도 양성반응을 보이는 세포가 관찰되었다. 양성 반응을 보이는 세포는 이행부 상피에서부터 증가하여 나타났으며 이행부조직의 표지지수도 진주종 상피와 외이도 상피의 중간값을 보였다.
이상의 실험 결과 Topoisomerase IIα는 중이 진주종의 과증식을 알 수 있는 증식표지자로 유용하며 과증식된 세포들은 이행부에서부터 상피쪽으로 이주하기 시작하는 것으로 생각되었다.
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