| Effect of IL-1beta on Hearing and Penetration through Round Window Membrane in Guinea Pig. |
| Chung Ku Rhee, Yong Ju Jang, Chung Soek Cho, Eui Jin Hwang |
| Department of Otolaryngology, College of Medicine, Dankook University, Cheonan, Korea. yjang@anseo.dankook.ac.kr |
| 기니피그에서 정원창막에 투여된 IL-1β에 의한 청력변화와 그 투과에 관한 연구 |
| 이정구 · 장용주 · 조정석 · 황의진 |
| 단국대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
IL-1βㆍ중이삼출액ㆍ감각신경성난청. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Interleukin (IL)-1beta has been detected in human middle ear effusion (MEE) and the MEEs of experimental otitis media. The object of this study was to investigate whether this cytokine 1) penetrates through the round window membrane (RWM) and 2) induces hearing loss.
MATERIALS AND METHODS:
Guinea pigs were randomly assigned as control and IL-1beta groups and each was subdivided into three different groups by applying 1 ng, 10 ng, 100 ng of IL-1beta on RWM. They underwent hearing test by auditory brainstem response (ABR) prior to experiments. In the ontrol group, 5nL of phosphate buffered saline (PBS) soaked in a small piece of gelfoam was applied on the RWM. In IL-1beta groups, three different concentrations of IL-1beta 1 ng, 10 ng, 100 ng soaked in a small piece of gelfoam were applied on the RWM. ABR measurements were performed at 3 and 6 hours after application of different concentrations of IL-1beta.
At the end of 6 hours, cochleas were harvested and perilymphs were collected for assay of IL-1beta level by the ELISA method.
RESULTS:
At 6 hours after application, the control group animals did not show any significant hearing loss. The IL-1beta were undetectable in perilymph of control group. In IL-1beta group, IL-1beta was detected in perilymph in dose dependent increasing concentrations. There was a significant hearing loss in this IL-1beta group in dose dependent manner in 3 and 6 hours. The hearing loss in 100 ng was significant comparing to control group.
CONCLUSION:
The result of this study indicated that IL-1beta applied on RWM penetrate to the perilymph and caused hearing loss. The result of this study suggest that IL-1beta in MEE may cause sensorineural hearing loss in guinea pig. |
| Keywords:
IL-1betaㆍMiddle ear effusionㆍSensorineural hearing loss |
서론
중이염은 합병증으로 감각신경성 난청을 유발할 수 있으며 그 빈도는 Draf와 Schultz에 의하면 만성 장액성 또는 점액성 중이염 환자의 35.8% 또는 87.9% 정도 나타난다고 한다.1) 이러한 감각신경성 난청의 병인론에 대한 설명으로 Paparella는 정원창막을 통하여 염증물질이 내이내로 들어가 독성미로염에 의한 일시적 청력손실이 올 수 있고 그에 따른 Corti씨 기관의 구조적 변화를 원인으로 제시하였다.2) 지금까지의 연구에 의하면, 중이강에서 분비된 염증매개체들이 중이염의 병인에 중요한 역할을 하며 동시에 내이의 기능적, 구조적 변화를 야기하는 것으로 알려져 있다. 염증매개체는 내피세포, 침윤성 염증세포, 상피세포에 의해 생성된 펩타이드, 혈당단백질, 인지질 등의 생화학적 구성성분들을 말하며 이들은 연속적인 과정을 통해 염증반응을 매개하며, 몇 가지의 염증매개체들이 중이삼출액에서 발견되고 있다. 이러한 염증매개체들은 중이의 정원창막을 투과하여 내이의 기능장애 및 형태학적 손상을 야기할 수 있다.2)3) 중이염의 합병증으로 나타나는 감각신경성 난청의 병인에 관여한다고 추정되는 염증매개체들에는 cytokines, prostaglandins, leukotrienes, platelet activating factor(PAF) 등이 있다.2) 이들 중 cytokine들은 염증세포와 조직에서 생성되며 면역반응을 조절하고 염증반응의 강한 매개체 역할을 하는 당단백질로서, 발열반응, 파골세포의 자극, 섬유화세포의 증식 및 자극, 조골세포의 분화 및 증식 그리고 대식세포의 발현 및 주화성의 활성을 나타낸다.4)5) 그 이외에도 cytokine들은 독성세포의 활성, 항체생성의 조절, 혈관내피세포와 연골억제 등의 작용을 나타낸다.6) 중이삼출액에서 발견되는 cytokine들은 삼출액의 형성과 유지, 점막손상, 골미란 그리고 이에 따른 청력감소 발현에 기여하는 것으로 알려져 있다.3)4)8) 삼출성 중이염에서 발견되는 cytokine들은 TNF-α, IL-1α와 β, IL-2, IL-6, IL-4, IL-8 그리고 γ-IFN이다.3)4) Cytokine들중 IL-1은 중이염의 초기단계와 관련이 있으며 α와 β의 아형으로 대별된다. IL-1α는 동물의 중이점막과 중이삼출액에서 발견되며 진주종성 중이염의 골파괴 기전에 관여한다.5)6) IL-1β는 사람과 실험동물의 중이삼출액에서 발견되며 IL-1β의 생성은 세균의 내독소에 의해 촉진되어 이는 다시 백혈구를 활성화시키면서 arachidonic acid pathway를 자극하여 다른 염증매개체들의 분비를 일으킨다.5) 본 연구의 목적은 삼출성 중이염에서 발견되는 cytokines중에서 IL-1β가 중이염에 속발하는 감각신경성 난청의 발현에 중요한 역할을 하리라는 가정하에, 첫째로 IL-1β가 기니피그의 정원창막을 통하여 외림프액으로 투과되는가를 측정하고, 둘째로 기니피그의 정원창막에 적용한 IL-1β는 청력감소를 유발하는가를 알아보고자 하였다.
대상 및 방법
대상
실험동물로는 체중 300∼350 g의 외견상 건강하고 광학현미경 소견상 중이내에 염증이 없는 기니피그 20마리(40 귀)를 사용하였으며 이들을 무작위로 대조군과 IL-1β의 두 군으로 나누었다. 대조군은 5마리(10귀)의 기니피그를 대상으로 5 μL의 phosphate buffered saline(PBS)을 1 mm 크기의 젤폼(gelfoam)(Johnson & Johnson, Skipton, UK) 조각에 적셔 중이의 정원창막에 적용시켰다. IL-1β군은 15마리(30귀)의 기니피그를 대상으로 1 ng, 10 ng, 100 ng의 농도에 따른 3개의 아군으로 나누고, 각 농도의 IL-1β(genzyme Diagnostics, Cambridge, MA, USA)를 젤폼조각에 적셔 정원창막에 적용하여 실험하였다.
방법
PBS, IL-1β의 적용
기니피그를 체중 kg당 30 mg의 ketamine과 30 mg의 xylazine hydrochloride를 혼합한 후, 근육주사하여 자기호흡을 유지한 상태로 전신마취를 하고 고정하였다. 골포 내의 정원창막을 노출시키기 위하여 이후부에 약 2 cm의 피부절개를 가하고 골포를 노출시켰으며 측두골포의 근막을 완전히 박리하여 제거한 후에 드릴을 이용하여 골포를 부분적으로 개방시키고 골포의 개방 후에 와우가 노출되면 정원창 부위를 확인하여 대조군에는 PBS 5 μL를, 실험군에는 1 ng, 10 ng, 100 ng의 IL-1β 5 μL를 젤폼조각에 적셔 정원창막에 적용시켰다.
청성뇌간유발반응을 통한 청력검사
대조군과 실험군은 PBS와 IL-1β 투여전과 투여후 3, 6시간에 청성뇌간유발반응을 통한 청력검사를 시행하였다. 청성뇌간유발반응은 증폭(Nicolet RGA-200 A) 및 여과(Band filter)(10 KHz) 되었으며, 검사당 256회 이상의 자극을 평균하였다(Nicolet CA-100). 자극음은 100 msec펄스의 교대극성에 의해 생성된 광역밴드의 클릭음을 33.3/sec의 비율로 TDH-49 insert earphone을 통해 귀에 삽입하여 주었다. 클릭강도는 90 dB peak sound pressure level에서 시작하여 청성뇌간유발반응이 나타나지 않을때까지 10 dB씩 감소시켰으며, 청력역치는 측정가능한 파형의 wave V를 보이는 최저 자극치로 결정하였다.
ELISA를 이용하여 측정한 IL-1β 농도
PBS와 IL-1β를 정원창막에 적용시켜 6시간 후에 IL-1β 각 6개의 귀를 사용하여, 외림프액과 뇌척수액이 섞이는 것을 방지하기 위하여 실험동물을 단두한 후 뇌척수액이 빠져나간 다음 정원창막과 와우 첨부에 구멍을 뚫고 1 cc 주사기를 이용하여 약 0.3 cc의 외림프액을 채취하였다. 정원창막을 통해 외림프내로 투과된 IL-1β의 농도는 ELISA kit(genzyme, Cambridge, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. ELISA에 의한 농도분석은 마우스의 Anti-IL-1β가 코팅된 kit의 플레이트(plate)를 이용하였으며 차단완충액으로 37℃에서 40분동안 차단하여 비특이적 반응을 제거한 후 ELISA과정에 들어갔다. 제시된 표준(405 ρg/ml, 135 ρg/ml, 45 ρg/ml, 15 ρg/ml, 0 ρg/ml)과 샘플을 넣고 37℃에서 40분간 항온배양 하였으며 샘플희석을 위해 세척완충액을 사용하였다. 4회 세척한 후 Horse radish pero-xidase(HRP)효소가 부착된 streptavidine을 37℃에서 25분간 반응시켰다. 세척후 기질로서 TNB용액을 이용하여 5분간 반응시켰으며 sulfuric acid로 반응을 중지시켰다. 다음에 ELISA reader(Emax precision microplate reader , Molecular Device, CA)로 판독하였으며 발색정도에 따라 농도를 구하였다.
통계처리방법
대조군과 IL-1β군 사이의 청력변화 및 외림프액에서의 농도를 비교하기 위하여 oneway ANOVA법을 이용하여 5% 유의수준에서 통계적 분석을 하였다.
결과
외림프액에서의 IL-1β의 농도
IL-1β군에서, 1 ng 아군은 18±2.4 ρg/ml, 10 ng 아군은 96±12.9 ρg/ml, 100 ng 아군은 409±28.9 ρg/ml의 농도를 나타냈으며, 10 ng 100 ng의 아군은 1 ng 아군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 보였으며 100 ng 아군역시 10 ng 아군에 비하여 유의한 차이를 보였다(p<0.05)(Fig. 1). 따라서 외림프액에서의 IL-1β 농도는 적용된 IL-1β의 농도에 비례하는 투과를 보여주고 있다.
청성뇌간유발반응을 통한 청력변화
대조군에서, PBS 투여전, 투여후 3시간, 6시간에 측정한 청력은 13.3±5.1 dB, 16,7±6.8 dB, 20.2±2.0 dB을 보였다. IL-1β군은 100 ng 아군에서 3시간후에 26.9±4.2 dB, 6시간후에 36.3±6.1 dB의 청력감소를 보였으며, 이는 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이였고, 1 ng, 10 ng 아군과의 비교에서도 통계적으로 유의한 청력감소를 보였다(p<0.05)(Table 1). IL-1β 10 ng 아군에서 6시간 후에 측정한 청력은 대조군과 비교하여 10 dB의 청력감소를 보였으나 이는 통계적으로 유의성이 없었다. IL-1β 1 ng 아군에서 6시간 후에 측정한 청력은 18.8±4.2 dB 이며, 이는 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다.
고찰
중이염에 속발하는 감각신경성 난청의 기전은 현재까지 명확히 이해되지 않고 있으나 세균감염, 내독소, 염증생성물, 면역반응 등이 원인인자로써 제시되고 있다.9)10) 정원창막은 중이와 내이를 구분짓는 유일한 연조직 구조로서 이 구조를 통하여 중이염에 속발하는 내이장애가 야기되는 것으로 이해되고 있다.11) 정원창막은 세층으로 구성되어 있다. 외층은 고실갑각과 인접한 상피세포와 상피하결합조직으로 이루어져 있고, 중층은 상피하결합조직과 내층사이에 위치하며 결합조직은 섬유세포(fibrocyte), 교원섬유(collagen) 및 탄력섬유로 구성된다. 내층은 와우의 고실계를 덮고있는 중피세포의 연장이라 할 수 있다.11) 정원창막의 투과성에 관한 연구는 중이염이나 이독성 약물의 투여에 의한 내이병리 및 감각신경성 난청을 이해하는데 중요하다. 정원창막은 항원, 혈장단백질, 백혈구생성물, 세균생성물을 포함한 대부분의 물질(MW<10.000)에 대해 투과성을 나타낸다. 심지어 대분자단백질도(MW 45.000) 세포흡수작용(pinocytosis)에 의해 정원창막을 통과할 수 있으므로 cytokine들의 투과도 예상할 수 있다.12) 실험적 중이염모델을 통한 관찰에서 정원창막의 투과성 증가는 주로 정원창막의 결합 조직층과 상피막의 변성에 기인하는 것으로 추정하고 있다.12) Harris 와 Ryan은 중이강에 KLH(Antikeyhole Limpet Hemocyanin)을 투여하여 외림프액에서 KLH의 증가를 관찰함으로써, 정원창막을 통하여 직접 항원이 확산되며, 또한 정원창막을 통해 투과된 항원에 의하여 내이에서 항체가 국소적으로 생성될수 있는 가능성에 대하여 언급하였다.13) Goycoolea와 Juhn은 포도상구균발열내독소(staphylococcal pyrogenic endotoxin)가 정원창막을 통하여 내이로 투과되며, 50 ng/ml 농도의 pseudomonas aeruginosa 내독소가 정원창막을 통하여 내이로 투과되어 와우유모세포 손상을 야기하였음을 보고하였다.14) 많은 염증매개체들이 삼출성 중이염에서 발견되고 있으며, 이들은 중이강에서 혈관투과성과 중이점막의 분비능력을 촉진함과 동시에 내이로 투과되어 청력감소를 야기하는 것으로 알려져 있다.11)15) Cytokine들 중에서 IL-1은 TNF와 더불어 중이를 포함한 거의 모든 조직에 영향을 주며 이들은 세균성 지다당류(bacterial lipopolysaccharide), 감염, 그리고 염증자극에 대한 중요한 생물학적 매개체이다. Catanzalo 등은 IL-1, IL-2, TNF를 기니피그의 고실을 통하여 주입하여 중이삼출액이 생성됨을 확인하였다.16) Juhn 등에 의하면 소아 삼출성중이염에서 측정한 IL-1β의 농도는 화농성에서는 176.82±81.72, 점액성에서는 29.84±7.19, 장액성에서는 8.08 ±3.35 pg/mg total protein(TP) 이며, 이를 요약하면 화농성중이염에서 점액성이나 장액성중이염에 비하여 높은 농도의 IL-1β가 측정되었다고 하였으나 아직까지 삼출액의 성상에 따라 cytokine 농도에 차이를 보이는 정확한 기전은 알려져 있지 않다.18) 삼출성 중이염에서의 염증매개체들이 감각신경성 난청을 일으킬 수 있으리라는 이론적 배경과 실험을 바탕으로, 정원창막에 위치시킨 염증매개체들이 와우기능에 미치는 영향에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다. PGE2, LTC4, PAF를 정원창막에 위치시킨 후 1, 2, 4, 8시간 후에 청성뇌간유발반응을 통한 청력변화에서 PGE2군은 미미한 청력변화를, LTC4군은 경도의 가역적 청력감소를, PAF군은 중증도의 비가역적 청력감소를 보인 바 있다.18) 삼출성 중이염 및 만성 중이염 환자에서 감각신경성 난청이 발생하는 것은 잘 알려진 사실이지만 중이염의 어느 시점에서 어떠한 병인으로 발생하는 지의 정확한 원인과 기전은 알려진 바 없다. 본 실험에서는 이전의 실험들을 통해 사람의 중이삼출액에서 측정된 바 있는 IL-1β가 중이 삼출액에 존재시 중이의 정원창막을 투과하는 지의 여부와 외림프액에 존재할 때 청력감소를 일으키는가의 여부를 확인하려고 하였다.19) 사람의 중이삼출액에서 발견된 IL-1β에 의해 청력감소를 일으키는 임계농도에 관한 연구는 현재까지 보고된 적이 없다. 따라서 본 실험을 하기 전, 사전검사로서 Juhn 등의 실험에 의해 사람의 중이 삼출액에서 측정된 IL-1β의 농도 0.11-3.5 ng/ml를 참고하여 0.001∼0.1 ng/ml의 농도를 적용 하였을때 의미있는 투과 및 청력감소를 관찰할 수 없었기 때문에 1 ng, 10 ng, 100 ng의 IL-1β 농도를 적용하여 실험을 하였다.19)20) 본 실험에서는 IL-1β 투여 3시간과 6시간후의 청력을 측정하였는데, 투여시간을 이와같이 선택한 이유는 사람의 삼출성 중이염에서는 수개월 이상의 경과 후에 감각신경성난청이 관찰되나, 실험동물 연구에서 IL-1β를 정원창막에 적용한 후 수시간 이상 유지시키는 것은 가능하지 않다. 따라서 어느정도 고농도의 IL-1β를 정원창막에 적용시켜 3, 6시간의 단시간내에 청력감소를 관찰함으로써 삼출성 중이염에서 IL-1β가 감각신경성난청을 유발시킬 수 있는지의 여부를 실험하여 보는 것은 타당하다고 사료된다. 외림프액내의 IL-1β는 정원창막에 적용된 IL-1β의 농도에 비례하는 투과를 보였으며, 정원창막에 적용된 IL-1β의 농도에 비례하는 청력감소를 일으킴은 의미있는 결과이다. 이는 중이삼출액에 존재하는 IL-1β의 농도에 비례하는 청력감소와 내, 외유모세포의 변화를 예측할 수 있으며 농도가 높을수록 더 심한 청력감소와 내, 외유모세포의 변화를 유발시킬 수 있음을 의미하는 것으로 볼 수 있다.
결론
본 연구의 결과, 중이 삼출액에서의 Il-1β가 삼출액내의 농도에 비례하여 외림프액으로 투과되었으며, 청력 감소 정도는 외림프액내의 IL-1β의 농도에 비례하였다. 이러한 결과는 중이 삼출액에 존재하는 IL-1β는 정원창막을 통과하여 청력감소를 일으킬 수 있는 가능성을 제시하는 결과라고 할 수 있다.
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