| Clinical Significance of Expression of Plasminogen Activatiors in Aural Cholesteatoma. |
| Hyung Jong Kim, Jin Hwan Kim, Hyun Joon Lim |
| Department of Otorhinolaryngology-Head & Neck Surgery, College of Medicine, Hallym University, Seoul, Korea. hjk1000@www.hallym.or.kr |
| 중이진주종에서 플라스미노젠 활성인자 발현의 임상적 의의 |
| 김형종 · 김진환 · 임현준 |
| 한림대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| 주제어:
중이진주종ㆍ플라스미노젠 활성인자ㆍ면역조직화학염색ㆍ임상적 병변. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Bone destruction is characteristic of aural cholesteatoma. Plasminogen activator (PA), one of serine proteases, acts as the specific trigger in a proteolytic cascade, which may play a certain role in cholesteatomatous destruction. We investigated the relationship between the degree of PA expression and clinical severity of cholesteatoma.
MAERIALS AND METHODS: Twenty six gerbilline cholesteatomas and 22 human cholesteatoma tissues were used.
Immunohistochemical stainings were performed using antibodies against urokinase type-PA (u-PA) and tissue type-PA (t-PA), respectively. The degrees of expressions of both PAs were scored by a pathologist using a four step grading system of one negative to three positives, and were also objectively measured by an image analysis program using the black and white densitometry. Clinical stages in animal cholesteatoma and the presence of preoperative otorrhea, ossicular destruction, bone destroying complications, type and extent of cholesteatoma in a human group were used as clinical parameters in determing the disease severity.
RESULTS:
PA immunoexpressions were more intense in cholesteatoma than in normal skin, especially in suprabasal layer of the epithelium. The intensities of PA expression also increased as the stage of cholesteatoma became more advanced in an animal model. However, in human cholesteatoma, they didn't show any differences between the groups according to disease severity, although there was a difference of PA expression between the pars tensa and flaccida type cholesteatomas.
CONCLUSION:
PA may play a role in the pathogenesis, and possibly progression, of aural cholesteatoma. |
| Keywords:
CholesteatomaㆍPlasminogen activatorㆍImmunohistochemistryㆍClinical severity |
서론
중이진주종은 병변이 진행함에 따라 주변 골 조직의 파괴를 일으키는 염증성 질환으로 심하면 심각한 두개내 합병증을 초래할 수 있어 신속하고 적절한 처치를 필요로 하는 질환이다. 주변 골 조직의 파괴는 중이진주종에서 특징적인 과증식된 상피세포와 상피하조직에서 분비되는 물질에 의해 촉진되는 것으로 알려져 있지만 정확한 기전에 관해서는 아직 논란이 있다.
플라스미노젠 활성인자(plasminogen activator；이하 PA로 약함)는 플라스민 전구물질(plasminogen)을 플라스민(plasmin)으로 활성화시키고, 활성화된 플라스민은 다시 교원질 분해효소 전구물질(procollagenase)을 교원질 분해효소(collagenase)로 치환하는 단계적 촉매작용을 하는 것으로 알려져 있으며 PA는 일반적으로 면역생물학적 특성에 따라 tissue type-PA(t-PA로 약함)와 urokinase type-PA(u-PA로 약함)로 분류하여 취급한다.1)2) PA는 이와 같이 세포외 기질의 주성분인 교원질을 분해하는 강력한 단백분해효소인 교원질 분해효소를 생산함으로써 플라스민에 의한 혈전 용해작용 뿐만 아니라 교원질 분해효소에 의해 악성종양의 조직 침습성에도 관여하는 것으로 보고되었으며 창상치유 과정에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.3-5)
중이진주종에서 국소조직 침습성에 교원질 분해효소가 중요한 역할을 한다는 것은 잘 알려져 있고, 병변의 진행 및 골 파괴 성질은 진주종의 조직 침습성과 깊은 연관이 있으므로 PA가 중이진주종에서 합병증을 초래하는 중요한 요인인 골 조직 파괴에 어떤 역할을 할 것이라는 가정을 할 수 있다.6-9) 또한, 악성종양에서 조직 침습성에 관여하는 것으로 알려진 PA를 정상피부와는 달리 중이 진주종 조직에서 분리할 수 있었다는 타 연구자의 보고도 있었다.10) 그러나, 중이진주종에서 PA에 의한 조직 침습성을 알아보기 위해 병변 정도와 PA의 발현 정도간에 연관성을 증명한 연구는 국내외 문헌상에 찾아보기 힘들다.
본 연구에서는 사람과 동물모델에서 정상 외이도 상피와 진주종 상피 조직을 채취하여 면역조직화학적 염색을 시행함으로써 u-PA 및 t-PA의 발현 부위 및 정도를 비교하고 진주종 병변의 심한 정도와 PA의 발현 정도간에 상관 관계가 있는지 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
재료
동물 모델로서 60∼90일 된 mongolian gerbils(body weight 50∼60g, male) 26마리를 사용하여 Kim과 Chole의 방법11)으로 우측 귀의 외이도를 결찰함으로써 진주종을 유발시켰고, 좌측 귀는 대조군으로서 관찰하였다. 임상병변의 심한 정도는 실험 동물을 희생하는 시점의 실험적 진주종 병기로서 표현하였으며11) 각각 1기가 다섯 귀, 2기가 열여섯 귀, 3기가 세 귀, 그리고 4기가 두 귀로 분류되었다.
사람의 중이 진주종 조직은 한림대학교 부속 강동성심병원 이비인후과에서 수술 도중 채취한 조직 중 표본상태가 좋은 22례와 대조군으로서 5례의 정상 외이도 피부조직을 사용하였다. 임상병변의 심한 정도는 술전 이루(유 16례, 무 6례), 이소골 연쇄의 파괴(유 18례, 무 4례), 외임파누공, 안면신경마비을 포함한 골 파괴 합병증(유 7례, 무 15례), 진주종의 범위(상고실에 국한 3례, 유양동 5례, 유돌부 14례), 그리고 진주종의 유형(이완부형 10례, 긴장부형 12례)으로 각각 나누어 진주종 조직에서 PA 발현정도에 차이가 있는지 각 군을 비교하였다.
방법
면역조직화학적 관찰
진주종 유발 동물을 기간별로 희생시켜 10% 중성 포르말린 용액으로 심장관류 고정한 후 양측 중이 골포를 en bloc으로 채취하였다. 탈회 및 연속탈수하고 파라핀에 포매한 후 와우축과 추골병이 지나는 횡단면으로 절편을 만들어 사용하였다. 사람의 중이 진주종 표본은 수술시 채취한 조직을 10% 중성 포르말린 용액에 넣어 24시간 고정시킨 후 탈수하여 파라핀에 포매하였으며, 이 조직을 4 μm 두께의 연속 절편을 만들어 표본상태가 양호한 것을 사용하였다.
위와 같이 제작된 동물 모델과 사람의 진주종 조직 표본을 silanized slide(DAKO corp.)에 부착시켜 56℃에서 30분간 항온처리하고, xylene으로 10분간 4회 탈파라핀화하고 연속적 알콜과 증류수로 함수시켰다. 과산화수소와 무수 알코올이 1：9의 비율로 혼합된 용액에 10분간 반응시키고 phosphate buffered saline(PBS)으로 3회 세척한 후 정상 염소 혈청에 10분간 처리하였다. 4℃에서 16시간동안 1차 항체와 반응시키고 PBS로 씻어낸 뒤 실온에서 30분간 2차 항체와 반응시켰다. 다시 PBS로 씻은 후 streptavidinperoxidase(Zymed Laboratories Inc., USA)를 30분간 실온에서 반응시키고 다시 PBS로 씻은 뒤 발색제인 AEC(3-amino-9-ethyl carbarzole, Zymed Laboratories Inc., USA)를 10분간 반응시켰으며 GVA mount(Zymed Laboratories Inc., USA)로 wet mounting하고 광학현미경하에 관찰하였다. 음성대조 염색으로서 1차항체 대신 PBS만 도말시킨 표본을 비교하였다.
u-PA 항체는 토끼에서 생성한 mouse urokinase에 대한 단크론성 항체(American diagnostic Inc., USA)를 사용하였고, t-PA 항체는 역시 토끼에서 생성한 mouse t-PA에 대한 단크론성 항체(American diagnostic Inc., USA)를 사용하였다.
면역조직화학적 염색의 판정
염색 정도의 판정은 임상양상을 알지 못하는 병리 전문의가 주관적으로 시행하였고(주관적 판정) 이와는 별개로 좀더 정량적인 판정을 위해 black-and-white densitometry를 이용한 image analysis 법을 써서 각 표본의 염색정도를 정량적으로 나타내었다(image analysis 판정). 주관적 판정은 1차항체 대신 PBS만 도말시킨 표본의 염색 강도를 (-)으로, 세포막 주위에만 미세한 연한 적갈색으로 염색된 경우를 약양성(＋)으로, 400배 시야를 거의 채우는 정도로 염색된 경우를 중등도 양성(＋＋)으로, 그리고 400배 시야를 완전히 넘어서는 정도로 염색된 경우를 강양성(＋＋＋)으로 판정하였으며 우선 100배 현미경 시야에서 염색이 잘된 부위를 확인한 후 400배 현미경 시야에서 10회 판독하여 평균치를 구하였다. Image analysis 판정은 Olympus사의 videomicrographs을 사용하여 면역조직화학적 염색이 시행된 진주종 상피의 기저층과 기저층 상부의 조직을 black-and-white 영상으로 변환시키고 한 시야에서 가장 밝은 부위를 0, 가장 어두운 부위를 200으로 영점 조정한 후 200배 현미경시야에서 다섯부위를 무작위 선정하여 density score를 측정하고 평균치를 구하였다. Image analysis 판정을 위해 Imascan Chroma-P의 video-board 및 Image-Pro Plus(version 1.3)의 software program을 사용하였다.
통계학적 검증
염색 정도의 주관적 판정 결과 및 image analysis 판정 결과 및 임상병변의 심한 정도와 관련이 있는지 비교하기 위한 통계학적 검증은 SPSS PC Plus program(SPSS PC plus for windows, Release 6.0 beta 1, SPSS Inc.)의 X 2-test, t-test 및 one way ANOVA법을 사용하여 각각 분석하였고, 통계학적 유의 수준은 p<0.05로 하였다.
결과
동물 모델에서 병기에 따른 u-PA 및 t-PA 발현 정도의 비교
동물 모델에서 u-PA 및 t-PA의 발현(Fig. 1)은 상피 기저층에서는 정상 외이도 피부와 진주종이 비슷하게 약양성으로 관찰되었으며 진주종의 병기가 진행됨에 따라 image analysis를 통한 density score에서 다소 발현의 차이가 관찰되었으나 통계학적으로 유의하지는 않았다(p>0.05).
상피 기저층 상부에서는 u-PA 및 t-PA의 발현이 각각 진주종에서 정상보다 강하게 관찰되었고 density score에서도 진주종의 병기가 진행됨에 따라 u-PA 및 t-PA 모두 발현이 증가되는 경향을 보였다(p<0.05)(Fig. 2).
사람 진주종에서 병변 정도에 따른 u-PA 및 t-PA 발현 정도의 비교
u-PA 및 t-PA의 발현은 정상과 진주종 모두 상피 기저층보다 기저층 상부에서 강한 발현이 관찰되었고(Fig. 3) 주관적판정에서 진주종은 정상 외이도에 비하여 기저층 상부에서 강한 발현을 보였으나(p<0.05), image analysis 판정에서는 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.05)(Table 1).
임상병변 정도로서 술전 이루, 이소골 연쇄의 파괴, 술전 합병증의 유무 및 진주종의 범위에 따라 군을 분류하여 u-PA 및 t-PA의 발현을 image analysis 판정(density score)으로 비교하였을 때 모두에서 각 군간의 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 그러나, 진주종의 유형에 따라 비교하였을 때 u-PA는 이완부형(49.9±3.6)이 긴장부형(33.8±3.1)보다 상기저부의 발현이 강하였고, t-PA는 이완부형(31.7±4.3)이 긴장부형(16.9±2.5)보다 기저부의 발현이 강하게 관찰되었다(p<0.05)(Table 2).
고찰
플라스미노젠 활성인자(plasminogen activator；이하 PA로 약함)는 각질세포를 포함한 다양한 종류의 세포 및 조직에서 분리되는 serine 단백분해효소(protease)의 일종으로 국소적 단백분해 작용에 직, 간접적으로 관여한다고 한다.1)2) PA의 체내 역할에 관해서는 혈전용해 작용이 가장 널리 알려져 있지만, 악성종양의 조직 침습성,3) 창상치유과정4)5) 및 염증반응에도 관여하고,12) 건선을 비롯한 피부질환이나,13)14) 부비동에서 기원한 비용종15) 및 중이진주종10) 등 다양한 조직으로부터 분리가 되며 여러 가설이 제시되었지만 정확한 작용 및 기전에 관해서는 아직 연구 중인 상태이다. PA는 전혀 다른 유전자에 의해서 생성되는 분자량 54 kD의 urokinase type PA(u-PA로 약함)과 분자량 70 kD의 tissue type PA(t-PA로 약함)로 구분되고 면역학적으로 서로 상호반응 않으며 결합부위와 체내 작용도 달라 서로 구분하여 취급한다. u-PA는 세포막 수용체와 결합하여 세포외 기질의 단백분해 작용을 하고, t-PA는 fibrin에 결합하여 fibrin 용해 작용에 관여함으로써 각각 악성종양전이에서 조직 침습성3)이나 창상치유과정에서 각질세포이동의 기전을 뒷받침하고 있다.4)5)
건선을 비롯한 과증식 피부질환에서 PA의 발현 및 역할에 관하여 많은 연구가 있었으나 역시 각질세포의 과증식을 특징으로 하는 중이 진주종에서는 PA에 관한 연구가 많지 않다. 정상상피에 비하여 건선 병변이 있는 상피에서 두 종류 PA의 발현이 모두 증가하지만 u-PA는 기저세포 부근에서 t-PA는 바깥 쪽의 각질상피세포에서 발현이 증가하여 발현 부위가 다르다고 하였다.13)14) 본 연구의 결과에서 정상피부 조직에 비하여 진주종 조직에서 u-PA 및 t-PA 의 발현이 증가된 것이 관찰되었고 특히, t-PA의 발현이 바깥 쪽의 상피세포에서 현저하였으나 상기저층에서만 발현의 차이가 있었고, 기저층의 발현은 u-PA, t-PA 공히 미약하였다. 이 결과는 건선 뿐만 아니라 진주종에서도 정상피부에 비하여 PA의 발현이 증가됨을 의미하며 각질세포의 과증식이 있고 염증반응이 있는 조직이란 공통점에서 이 결과를 해석할 수 있다. 그러나 기저층에서의 발현이 미약하였고 상기저층에서만 발현의 차이가 관찰된 것은 건선 연구의 결과와 다소 차이가 있었으며 이는 진주종 발생기전에 상기저층에서 주로 발현이 되는 t-PA의 역할이 중요하고 t-PA에 의한 상피세포의 이동이나 창상치유 과정이 중이진주종의 발생에 중요한 역할을 함을 시사한다. 또한 사람과 동물모델의 결과가 일치하였고 염증의 정도도 실험군내 고르게 분포하였으므로 이 결과는 의미가 있다고 할 수 있다. 그러나 기저층 가까이에서 발현되는 것으로 알려진 u-PA의 염색에서 실험조건이 최적이 아니었음을 배제할 수 없으며 이는 추후 검정이 필요한 과제이다.
본 연구에 사용한 동물모델의 유용성은 이미 이전의 연구16)에서 언급하였듯이 사람에서 얻을 수 있는 진주종조직에 비하여 치료가 안된 상태의 조직을 얻을 수 있으므로 질환의 자연 경과를 관찰할 수 있다는 장점을 들 수 있다. 또한, 병변의 심한 정도에 따라 인자분석이 가능하고 정량분석을 할 수 있으므로 앞으로 진주종에 대한 새로운 치료법의 효과 검정도 가능할 것으로 생각된다. 본 연구에서 이 동물모델을 이용한 결과로서 병변의 진행에 비례하는 PA 발현의 증가 경향이 관찰되었다. 이 결과는 진주종 병변의 진행에 특히, 상기저층에서 PA가 중요한 역할을 함을 의미하며 다음 단계의 연구로서 사람의 진주종에서 병변의 정도에 따른 PA발현 정도의 연관성 검사를 할 수 있는 근거 자료로서 가치가 있다. 다만 본 연구에서 제 4 병기 표본의 수가 너무 작아 앞으로 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.
조직에서 PA와 같은 효소의 발현을 정량화하기 위해서는 면역조직화학 염색을 통한 발현을 정량적으로 측정하는 법 외에 효소면역법(enzyme linked immunosorvent assay, ELISA),16) 형광 항체를 부착시킨 후 유세포계측,17) 그리고 조직에서 m-RNA의 양을 측정하는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 이용하는 방법 등 여러 가지가 있을 수 있다. 모든 방법이 장, 단점이 있고 완벽한 정량적 측정에는 한계가 있어 상호확인할 수 있도록 두 가지 이상의 방법을 병용하는 것이 추천된다. 본 연구에서는 첫 단계로 면역조직화학 염색을 통한 발현을 정량하는 방법으로 image analysis법을 사용하였으며 보다 객관적 측정을 위해서 다음과 같은 조건을 지켰다. 한 종류의 항체를 사용한 염색은 동시에 한 뱃취에서 똑같은 조건으로 시행하였고, 각 슬라이드마다 조직이 없는 부분을 0, 가장 어두운 부분을 200으로 내부 영점조정한 후 측정하였으며, 무작위 표본추출을 위해 세포층에 수평으로 눈금자를 대고 일정 간격으로 교차하는 세포질에서 측정하였다. 표본채취 부위는 동물모델의 en bloc 측두골조직의 일정부위인 심부외이도에서 측정하여 오차를 줄일 수 있었다. 다만, 사람의 진주종조직에서 표본채취 부위를 일정하게 하는데는 어려움이 있어 결과에 영향을 미쳤을 가능성을 배제할 수 없다. 본 연구에서는 면역조직화학적 발현을 병리전문의 일인이 시행한 주관적 판정에 의한 측정과 image analysis법을 사용한 객관적 측정의 두 가지 방법을 함께 하여 image analysis법의 유용함을 알아보고자 하였다. 두 가지 방법을 통하여 발현의 크고, 작음은 완전히 일치하는 결과를 얻었지만 일부에서 통계적 유의성 검사 결과상 일치하지 않는 결과를 보여 방법상의 보완이 필요할 것으로 사료된다. 다음 단계로 저자들은 진주종 각질세포를 배양한 후 유세포계측하는 방법과 진주종 조직에서 m-RNA의 양을 측정하는 방법을 병용하는 연구를 진행 중이다.
본 연구의 결과에서 사람 진주종 조직이 정상 피부에 비하여 상기저층에서 PA 발현이 증가되었음은 관찰되었으나 임상병변의 심한정도에 따른 군 간에 PA 발현의 차이는 관찰되지 않았다. 이것은 기대하지 않았던 결과로 사람에서 진주종의 병변의 정도와 PA의 발현은 연관이 없다는 것을 뜻한다. 그러나 본 연구에서 병변의 심한 정도로써 사용된 술전 이루, 이소골 파괴, 골파괴 합병증의 유무 및 진주종의 범위 등의 인자 선택이 부적절하였을 가능성을 배제할 수 없고, 진주종은 흔히 비균질적인 조직상을 보이는 이유로 조직을 채취한 부위에 대한 고려도 하여야 하기 때문에 성급한 결론을 내리는 것은 무리가 있다. 보다 정확한 결론을 위해서는 진주종 병변에 의한 염증의 정도를 표시할 수 있는 지수나 파골세포 지수와 같은 골파괴의 정도를 수치화한 인자를 사용하고 동시에 일정한 부위에서 조직을 채취하는 것이 필요할 것으로 생각된다.
본 연구에서 진주종의 병변 정도에 따른 차이는 없었지만 진주종의 유형에 따른 PA 발현의 차이가 관찰된 것은 진주종 발생에 PA의 역할을 암시하는 결과로 볼 수 있다. 이완부형이 긴장부형에 비하여 PA 발현이 증가한 결과는 이완부형 진주종에서 각질세포가 중이로 침습하는 기전을 PA의 단백분해작용에 의해 세포외 기질이 제거됨으로써 침입 통로가 만들어진다는 가설로 설명할 수 있을 것이다.
요약하면, 진주종상피의 상기저층에서 대조군에 비해 PA의 발현이 증가하였고, 동물모델에서 병변이 진행됨에 따라 PA 발현의 정도도 증가하였다. 사람의 진주종에서 병변의 진행정도와 PA 발현의 정도가 비례하지 않았으나 진주종의 유형에 따른 PA 발현의 차이가 관찰되어 진주종 발생기전에 PA의 역할을 시사하였다. 추가 연구를 통하여 진주종의 진행과 PA의 발현의 연관성이 밝혀진다면 PA의 발현정도를 진주종의 진행 및 합병증 발생 등 임상적 예후를 판정하는 진단적 목적으로도 이용할 수 있을 것이다.
결론
중이 진주종에서 대조군에 비해 PA의 발현이 증가하였고, 동물모델에서 병변이 진행됨에 따라 PA 발현의 정도도 증가하였다. 그러나, 사람에서는 병변의 진행과 PA 발현이 대부분 연관이 없는 결과를 보여 진주종 병변의 진행과 PA의 발현의 연관성을 증명하기 위해서는 보다 정량적인 방법을 통한 재검정이 필요하다.
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