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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(1): 7-12. |
| Role of Superoxide Dismutase in Eustachian Tube of Rat with Acute Otitis Media. |
| Han Kyu Suh, Jeong Su Woo, Eun Soo Lee, Sang Hoon Shin, Hyun Ho Lim, Soon Jae Hwang |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Korea University School of Medicine, Seoul, Korea. kughent@nuri.net |
| 급성 중이염 흰쥐의 이관점막에서 Superoxide Dismutase의 역할 |
| 서한규 · 우정수 · 이은수 · 신상훈 · 임현호 · 황순재 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| 주제어:
Superoxide dismutaseㆍ이관점막ㆍ급성중이염. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Superoxide dismutase (SOD) is an important protective enzyme against biochemical injury associated with inflammatory reaction. SOD are found in the epithelium of the normal middle ears and lesser amounts are found in infected ears. However, the localization of the SOD in the Eustachian tube in the normal and infected ear has been poorly studied. This study attempted to determine the distribution of SOD and how it changes from normal to infected.
MATERIALS AND METHODS:
We used fifty male Sprague-Dawley rats to observe the SOD expression and the change of its amount in the Eustachian tube using immunohistochemical method and western blotting.
RESULTS:
In normal rats, SOD was found in the epithelium of Eustachian tube and lower amounts were found in the connective tissue layers. In the streptococcus-infected ears, SOD was found in the similar pattern, but the infected tubal mucosa showed extensive submucosal edema and stained poorly with SOD, compared to the normal Eustachian tube mucosa. The amounts of SOD was 1.48+/-0.44ng/mg of protein in the normal mucosa and decreased markedly to 0.62+/-0.37ng/mg in the infected cosa.
CONCLUSION:
SOD was identified in the normal Eustachian tube; the amount decreased during the infected period. This finding suggests that SOD may have a protective role in the pathogenic state. |
| Keywords:
Superoxide dismutaseㆍEustachian tubeㆍAcute otitis media |
서론
세포손상을 초래하는 산소 대사물인 superoxide 음이온(O2-), hydroxyl 기근(OH-)과 과산화수소(H2O2) 등의 자유기는 정상적인 대사과정이나 고농도의 산소에 노출, 재관류에 의한 손상과 염증반응의 과정에서 생성되며 매우 반응성이 높고 불안정하여 조직내에서 단백질, 지방, 탄수화물, 핵산의 생화학적 변성을 일으켜 조직 손상을 초래한다.1-4) 자유기에 의한 손상으로부터 정상 세포의 방어 작용에 관여하는 효소에는 superoxide dismutase(이하 SOD로 약함), gluthathione peroxidase, catalase 등이 있으며 이 중 SOD는 산화성 독성 물질에 대한 항산화 기전의 하나로서 세포화학적, 생화학적 검출방법을 통하여 기관지, 폐포내 원주상피, 비강 점막 등 상기도 점막과 위장관과 신장 도뇨관 상피 및 내분비세포 등에 국재하고 있음이 보고되어 있다.5)6) 중이점막에도 SOD가 존재하며 방어기전을 담당한다고 알려져 있다.7)8)
급성 중이염은 주로 상기도 감염에 의하여 속발되며 이관을 통한 병원균의 중이강내 침범이 중요한 발병기전이 된다.9) 특히 급성 상기도감염시 바이러스가 이관의 섬모운동 및 환기 기능을 저하시키고 백혈구의 기능을 저하시켜 세균의 감염을 잘 일으키는 것으로 알려졌다.10) 따라서 저자들은 이관점막에서의 방어기전이 중이염발생에 큰 역할을 담당할 것으로 생각하여 정상 이관점막에서 SOD의 존재와 양을 확인하고, 실험동물에 급성 상기도감염을 유발한 뒤 이에 속발하여 급성 중이염이 발생한 동물의 이관점막에서 SOD의 분포와 양적변화를 정상의 것과 비교하여 중이염 발생에서 SOD의 역할을 확인하기 위하여 본 실험을 시행하였다.
재료 및 방법
실험 동물은 고막과 중이 질환이 없는 건강한 Sprague-Dawley계 흰쥐(체중 200∼300 g) 50 마리를 사용하였다.
급성 중이염 모형 제작
이경을 통하여 정상 중이 상태를 확인한 흰쥐의 우측 비강에 Influenza virus A Yohanesburg/45/90(국립보건원)을 0.2 ml(6×10 6 CFU) 점적하여 급성상기도염을 유발하였다. 실험 동물을 매일 관찰하여 비루, 결막 충혈 등의 상기도염 증상이 발생한 동물은 5일 후 1×10 8 CFU의 비피낭성(uncapulated) Streptococcus pneumoniae 부유액 0.5 ml를 비강을 통하여 주입하고 매일 이경으로 고막을 관찰하여 중이염의 발생 유무를 확인하였다. 대조군으로는 동량의 생리식염수만 비강내에 점적한 10마리의 흰쥐를 사용하였다. 이경 검사에서 화농성 이루, 고막의 발적 및 팽륜 등 급성 중이염의 증상이 발생한 동물만 선택하여 희생하였고 중이강내의 분비물과 비강점막에서 배양검사를 시행하였다.
면역조직화학적 염색
25% 우레탄(6∼8 ml/Kg), (Sigma, USA)을 복강내 주사하여 마취한 뒤 흉곽을 개방하여 4% paraformaldehyde, 0.1 M 인산 완충용액(pH 7.4, Sigma, USA)으로 심관류 고정하고 측두골을 분리하였다. 같은 용액으로 하루밤 후고정 시키고 Plank-Rynchlo용액(7g aluminum chloride, 8.5 ml hydrochloric acid, 5 ml formic acid, 100 ml DW)에 1일간 탈석회 하고 30% 자당(Sigma, USA)에 하루밤 담그어 cytoprotection하고 cryostat(Reichert-Jung, Germany)으로 15 m 두께의 연속 동결 절편을 만들었다.
동결 절편은 0.3% H2O2로 15분간 처리하여 내인성 과산화효소 활성을 억제 시키고 0.2 M 인산 완충 식염수로 5분간 3회 세척하였다. 비특이적 항원항체반응을 억제하기 위하여 30분간 정상 소 혈청(Vector, USA)으로 처리한 뒤 1：1000으로 희석된 sheep anti-SOD antibody(Biodesign, USA)를 부착시켜 4℃에서 하루 밤 처치하였다. 일차 항체로 처리된 동결 절편을 인산 완충 식염수로 수세하고 이차 항체(Biotin-labeled anti-sheep, Vector Lab, USA)로 1시간 처리하고 ABC방법(Vector Lab. USA)으로 면역조직화학적 염색을 시행한 뒤 diaminobenzidine(DAB, Sigma. USA)으로 처리하였고 배세포에 대한 대조염색을 위하여 alcian blue염색 후 탈수 및 봉합과정을 거쳐 광학 현미경(Olympus BH-2, Japan)하에서 발색반응을 관찰하였다.
Western blotting
후고정과 탈석회과정을 거친 측두골로부터 이관점막과 중이강 개구부쪽 점막을 포함하여(50∼100 mg) 박리하여 1.5 ml TRI reagent(Molecular Research Center, USA)에 넣고 유리 호모게나이저(Wheaton, USA)와 초음파 분쇄기(Tettec, Japan)를 사용하여 균질화하였다. Chloroform-isopropanol 처리를 통하여 단백질을 침전시키고 에탄올 처리로 단백질 침전을 얻은 후 1% sodium dodecyl sulfate(SDS, Sigma, USA)에 녹여 Bradford11) 방법을 이용하여 단백질을 정량하였다. 추출한 단백질 40 μg을 vertical electrophoresis system(Novex, USA)에서 10% SDS-PAGE을 사용하여 인체에서 추출한 순수SOD 0.1 μg(Sigma, USA)과 함께 전기영동하고 nitrocellulose막에 전사하였다. Nitrocellulose막을 면역조직학적 염색에 사용된 것과 동일한 일차항체와 Western-Light chemiluminescent detection system(Tropix, USA)을 이용하여 발색시킨 뒤 NIH Image analyzer(release alpha-9)를 이용하여 밀도를 측정하여 정상과 급성 중이염이 발생한 동물군의 이관점막에서의 SOD 농도를 비교하였다.
결과
비강내 바이러스 점적 후 Streptococcus pneumoniae를 주입한 40마리의 실험 동물 중 25마리에서 고막 발적, 팽륜, 화농성 이루 등의 급성중이염 소견이 관찰되었다. 이루에서 배양한 균검사 결과 10마리에서 Streptococcus Pneumonia가 배양되었고 그 외에 E. coli, E. cloaca, S. aureus 등이 검출되었으며 이 균들은 정상 비강내 균배양 검사에서 검출된 정상균주와 일치하였다(Table 1).
면역조직화학적염색 결과 중이강과 비인강 쪽 이관점막에서 염색반응의 차이는 없었으나 중이강 쪽에 비해 비인강 쪽에 배세포가 많이 존재하였고 이는 정상과 급성 중이염이 있는 경우 모두 동일하였다. 그러나 급성 중이염이 있는 경우 배세포 자체가 비후되어 있었고 배세포의 수도 증가되어 있었으나 배세포에서는 정상과 중이염군 모두에서 SOD의 발현이 없었다.정상과 급성 중이염에서 중이강에 인접한 이관점막에서는 편평형 상피세포내에서는 SOD가 고르게 분포되어 있었다(Fig. 1). 그러나 비인강에 인접한 이관점막에는 배세포가 많이 분포하여 중이강에 인접한 점막보다 고른 양성반응을 보이지는 않았다. 정상 이관점막에서는 SOD가 상피층에 주로 분포하였고 점막하층은 면역반응이 미약하였다. 반면 급성 중이염이 있는 점막에서는 비후되고 증가된 배세포를 보였고 상피세포에 양성반응을 보였으나 정상에 비해 염색정도가 감소하였고 점막하층에 염증세포의 침윤과 부종이 관찰되었으나 정상에서와 같이 면역반응은 미약하였다(Fig. 2).
정량분석을 위하여 시행한 western blot 결과 정상과 급성중이염이 있는 군에서 모두 분자량 16 Kd의 띠를 관찰할 수 있었으며 정상 대조군의 SOD띠가 급성 중이염보다 양과 발색정도가 높았다(Fig. 3). NIH Image analyzer에 의한 SOD의 농도 측정 결과 정상 이관점막의 농도는 1.48±0.44 μg/mg of protein 이었고 중이염이 발생한 이관점막에서는 0.62±0.37 μg/mg of protein로 중이염이 발생한 이관점막에서 SOD의 양이 현저히 감소하였다(Fig. 4).
고안
SOD는 호흡하는 세포내에서 산소의 대사적 환원에 의해 생성된 독성물질인 superoxide radical을 제거하는 효소로 포유 동물내에 세포내 copper, zinc SOD(CuZn SOD), mitochondrial manganese SOD(Mn SOD)와 세포외(extracellular) SOD(Ec SOD)가 존재한다.3) Superoxide radical은 효소 비활성과 지질막의 파괴를 통하여 세포 손상을 유발하는 산소 대사물로서 SOD에 의하여 H2O2와 O2로 분해된다. SOD는 지질산화를 방해하고 전리방사선이나 다른 기전으로 생성된 superoxide radical에 의한 핵산 손상과 protein sulfhydryl oxidation에 의한 병리적변화에 대하여 superoxide radical을 제거함으로써 반응성 자유기로부터 세포를 보호하는 것으로 알려져 있다.12)13) SOD는 인체의 거의 모든 장기에 존재하며 여러가지 생리학적 작용을 행하는데 당뇨병을 일으키는 Alloxan으로 부터 췌장세포를 보호하고, 안구의 염증이나 광화학반응으로 생긴 산화기로 부터 조직의 손상을 방어하는 작용을 한다.14-16) 중이 점막에서도 SOD가 존재하며 급성염증의 발생에 따른 자유기(free radicals)에 의한 점막의 손상을 보호하는 역할을 한다고 추정되고 있다.7)8) 그러나 Henderson 등9)의 보고처럼 대부분의 급성중이염은 상기도 감염에 속발되어 발생하며 중이염의 원인이 되는 박테리아의 97%가 환자의 비인강내에서 발견된다는 사실로 미루어 보아 비인강내의 병원균이 이관을 통하여 중이강 속으로 침범하므로 이관점막에서 점막의 손상을 보호하는 작용이 중요하리라 생각된다. 본 연구의 결과 급성 중이염이 발생한 25마리의 실험동물의 중이강내 이루에서 배양한 균검사에서 10마리는 비강내에 점적한 Streptococcus pneumoniae가 검출되었으나 나머지 15마리에서는 비강에서 배양된 정상 균주가 검출되었다. 위의 실험결과로 바이러스에 의하여 유발된 급성 상기도염에서 비인강내의 병원균이 이관을 통하여 중이강내로 유입된다는 사실을 알 수 있었으며 이관점막에서의 방어기능이 병원균의 유입이나 점막의 염증반응의 정도를 결정하리라는 추정을 할 수 있을 것으로 생각되었다.
면역조직화학 염색에서 정상 이관점막의 SOD는 점막 상피내에 강한 염색반응을 보였고 점막하 결체조직층에는 염색 반응이 미약하였다. 이러한 염색 양상은 기니픽의 중이 점막에서 SOD의 위치와 일치하였다.3) 배세포에 대한 대조염색 결과 배세포에서는 면역 반응을 보이지 않아 배세포 자체에는 SOD를 통한 항 산화 기전이 없는 것으로 생각되었다. 정량 분석 결과 면역염색의 결과와 동일하게 중이염이 발생한 이관점막에서 얻은 SOD의 양이 정상 이관점막보다 적었다. 이는 자유기를 분해하기 위하여 이관점막에 존재하던 SOD가 소모되었기 때문인 것으로 생각되며 실험 결과로 보아 이관점막의 SOD가 급성 중이염에서 자유기에 의한 점막손상을 보호하는 역할을 하고 있는 것으로 생각되었다.
결론
흰쥐의 비강에 바이러스를 점적하여 급성 상기도염을 일으키고 5일 뒤에 비강내에 박테리아를 다시 주입하여 급성 중이염을 유발하여 이관점막에서 SOD의 면역염색과 정량분석을 한 결과 급성 중이염이 발생한 이관점막에서의 SOD의 양이 정상 대조군에 비하여 현저히 감소되었다. 이 결과로 미루어 보아 이관점막에 존재하는 SOD가 급성 중이염에서 이관점막의 손상을 보호하는 역할을 하고 있는 것으로 생각되었다.
REFERENCES
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