| Amplification of int-2 in Head and Neck Squamous Cell Carcinomas and Adjacent Mucosa. |
| Il Whan Jang, Seung Chul Oh, Youn Sik Seok, Geon Choi, Jeong Soo Woo, Jong Ouck Choi, Kwang Yoon Jung |
1Department of Otolaryngology- Head and Neck Surgery, Gachon Medical College Gil Medical Center, Incheon, Korea.
2Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. |
| 두경부 편평세포암종의 원발암과 주위 점막에서 <i>int</i>-2의 증폭 |
| 장일환1 · 오승철1 · 석윤식1 · 최 건2 · 우정수2 · 최종욱2 · 정광윤2 |
| 가천의과대학부속 길병원 이비인후과학교실1;고려대학교 의과대학 이비인후과학교실2; |
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| 주제어:
<ㆍi>ㆍint<ㆍ/i>ㆍ-2 증폭ㆍ두경부 편평세포암종ㆍ인접 점막. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
It is important to identify potential biomarkers of tumorigenesis that can be utilized on histologically normal epithelia to determine the level of risk of tumor development. With the goal of possibly identifying a biomarker for the process of development of head and neck cancer, the amplification of int-2 was observed in patients with head and neck squamous cell carcinoma.
MATERIALS AND METHODS:
Fluorescence in situ hybridization using cosmid int-2 probe was performed on paraffin-embedded specimens from tumor and tumor-adjacent and tumor-distant epithelia of 20 patients. Buccal mucosa of cancer-free subjects who smoked and did not smoke cigarettes were used as control. Dot blot hybridization using digoxigenin-labeled int-2 probe was also performed on the frozen tissue from tumor and tumor-adjacent epithelia of 14 patients.
RESULTS:
In in situ hybridization, buccal epithelia of cancer-free subjects who smoked and did not smoke cigarettes, and tumor-distant epithelia of the patients with head and neck squamous cell carcinoma showed no int-2 amplification. However, eleven of tumor tissue (55%) and five of tumor-adjacent epithelia (25%) in 20 cases showed int-2 amplification. In dot blot hybridization, five tumor tissue (35.7%) and 2 tumor-adjacent epithelia (14.3%) in 14 cases, of which tumor tissue were all found to have int-2 amplification, showed int-2 amplification.
CONCLUSION:
The amplification of int-2 in the tumor tissue and the tumor-adjacent epithelia of the same cases supports the concept of field cancerization or clonal extension. Such genotype parameters may provide a genetic basis for the development of early recurrence or second primary tumors after therapeutic treatment of head and neck squamous cell carcinomas. |
| Keywords:
int-2 amplificationㆍHead and neck cancerㆍIn situ hybridizationㆍDot blot hybridization |
서론
두경부에 발생하는 편평세포암종(squamous cell carcinoma)은 영역 암발생(field cancerization)과 다단계의 발암과정(multistep carcinogenesis)을 연구하는데 있어 좋은 모델로 제시되고 있다. 영역 암발생은 술과 담배와 같은 발암물질은 상부 기식도관(upper aerodigestive tract) 전체에 노출되므로 발암물질에 노출된 전체 점막에서 암이 쉽게 발생할 수 있다는 개념을 적용한 것으로, 임상적 증거로는 편평세포암종이 상부 기식도관에 정상 점막을 경계로 하여 서로 떨어져서 중복으로 발생하는 중복암과 두경부 편평세포암종 환자를 적극적으로 치료하여 임상적으로 치료가 되었음에도 불구하고 수년 후 타부위의 상부 기식도관에 새롭게 편평세포암종이 발생하는 이차암을 들 수 있다.1) 다단계의 발암과정에 대한 연구로 두경부 편평세포암종의 주변에 이형성증(dysplasia), 과각화증(hyperkeratosis)과 같은 암전구증이 존재하는 것으로 알 수 있다.2) 또한 암전구증(precancerous lesion)이나 암과 같이 병리조직학적 변화가 발생하기 전에 발암 물질에 노출된 상부 기식도관의 점막에서 염색체나 유전자의 변화가 발생한다는 사실이 밝혀 졌다.3)4)
최근 두경부 편평세포암종에서 다발암 또는 이차암이 발생하는 이유로 변형된 클론(clone)이 점막하 또는 타액 등에 의해 원발암과는 떨어진 타부위의 상부 기식도관의 점막으로 퍼지고, 이렇게 퍼진 자리에서 진행된 암으로 성장함으로써 새로운 암이 발생한 것처럼 보이지만 실제로는 이들 다발암 또는 이차암이 원발암에서와 동일한 클론에서 기원한다는 클론 확산(clonal extension)의 이론도 제시되고 있다.5)
이들 두 가지 이론에 대한 논란이 지속되고는 있으나, 이들 두 가지 이론을 배경으로 두경부 편평세포암종 환자에서 종양의 국소 치료 후 타부위의 상부 기식도관에 암이 발생할 수 있을 가능성을 예견하는 염색체 및 유전자적 변화를 찾을 수 있다면 이들 염색체 또는 유전자의 변화를 찾아 암 발생의 가능성이 높은 고위험군을 선별하고 이들 환자에서 이차암을 예방하는 적극적인 시도를 할 수 있을 것이다.
연구의 목적은 두경부 편평세포암종의 특성인 영역암 발생 또는 클론 확산의 개념을 기초로 하여 두경부 편평세포암종 환자에서 종양과 종양의 주변의 병리조직학적으로 정상인 상부 기식도관 점막에서 fluorescence in situ hybridi-zation(FISH) 및 dot blot hybridization의 방법으로, int-2 유전자의 증폭을 관찰함으로써 int-2의 증폭이 이차암 또는 국소 재발의 가능성이 높은 고위험군을 선별하는 생체 표지자(biomarker)로서의 가능성이 있는지를 찾고자 하여 본 연구를 시행하였다.
재료 및 방법
두경부 편평세포암종으로 진단되어 수술적 치료를 우선적으로 시행하였던 34례를 대상으로 하였으며 이들 중 20례는 FISH법으로, 14례는 dot blot hybridization법으로 연구 대상 및 방법을 각각 나누어 실험을 실시하였다.
FISH법에 의한 연구
대상 및 절편의 제작
두경부 편평세포암종으로 진단된 20례의 환자로 이들은 부위별로 후두암이 10례, 구강암이 4례, 구인두암이 3례, 하인두암이 3례였으며, AJCC (American Joint Committee on Cancer, 1996) 6)에 따른 병기 분포는 2기가 2례, 3기가 14례, 4기가 4례였다. 술후 방사선 치료는 7례에서 시행하였다. 이들의 연령은 45세에서 73세로 평균 연령은 60세였고, 성별은 모두 남자였다. 모든 환자가 흡연의 기왕력이 있었으며, 흡연량은 20에서 120 pack-years이었고 평균은 48 pack-years이었다.
수술은 다양한 방법으로 시행되었으며 수술시 종양의 중심부(tumor tissue), 종양을 안전역(safety margin)을 두고 절제한 후 절제연에서 병리조직학적으로 정상인 점막(인접 점막, tumor-adjacent epithelia), 종양과 멀리 떨어진 협부 점막(buccal mucosa, tumor-distant epithelia)에서 조직을 채취하고, 대조군은 흡연의 기왕력이 있는 6명(흡연 대조군)과 흡연의 기왕력이 없는 6명(비흡연 대조군)의 자원자로 하였으며 이들에서 협부 점막을 채취하였다. 흡연 대조군의 흡연량은 15 pack-years 이상으로 평균 36 pack-years였다.
채취한 조직은 10% 중성 포르말린에 고정 후 파라핀에 포맷하여 5 μm의 두께로 잘라 ProbeOn Plus Microscope Slide(미국 Fisher Scientific사)에 부착하여 실온에 보관하였다.
실험 방법
조직을 65℃에서 12시간 및 80℃에서 1시간 동안 열 처리하여 다음의 실험 과정에서 슬라이드로 부터 조직의 이탈을 방지하고자 하였다. 조직을 실렌(xylene)에 10분간 3회 처리하여 파라핀을 제거하고, 100% 에탄올(ethanol)에 10분간 2회 처리하였다. 0.2N HCl이 함유된 0.4% 펩신(pepsin, 미국 Sigma사) 50 μl를 조직위에 처리하고 플라스틱 덮개(plastic cover slip)를 덮고 4℃에서 30분간 처리하여 펩신이 조직에 균일하게 퍼지게 한 다음, 37℃에서 60분간 처리하여 펩신 소화(digestion)를 실시하였다. 3분간 3회 증류수에 세척하고 70%, 90%, 100% 에탄올의 순으로 탈수한 후 실온에서 아세톤(acetone)에 2분간 처리하고 공기에 건조하였다. 내인성 과산화효소(endogenous peroxidase)의 활동을 억제하기 위하여 메탄올(methanol)에 용해한 3% 과산화수소에 5분간 처리하였다.
1X 인산완충액(phosphate-buffered saline, pH 7.4)으로 5분간 3회 세척 후 2X SSC(standard sodium citrate, pH7.0)에 함유된 리보핵산분해효소(ribonuclease, 1 mg/ml, 미국 Sigma사)로 37℃에서 60분간 처리하였다. 조직 슬라이드는 2X SSC로 3분간 3회 세척한 후 계열 에탄올에 탈수하여 공기에 건조하였다.
하이브리드 결합 혼합물은 2X SSC에 용해된 50% formamide(Oncor Hybrisol VII, Oncor사)에 digoxigenin이 부착된 int-2 cosmid probe(Oncor사)를 1.0 ng/ μl의 용량이 되도록 제작하였다. 제작된 하이브리드 결합 혼합물을 각 조직에 10 μl 씩 점적하고 조직을 25×25 mm의 덮개유리로 덮은 후 고무풀(rubber cement)로 주변을 봉한 후 90℃에서 12분간 처리하여 조직내의 DNA와 DNA probe를 동시에 변성시킨 후 37℃ 배양기에서 16시간 동안 하이브리드결합을 시행하였다. 덮개 유리를 제거하고 조직을 2X SSC에 용해한 65% formamide용액에 15분간 2회 실온에서 세척한 후, 0.1X SSC에 10분 동안 37℃에서 3회 세척하였다.
Fluorescein이 부착된 항 digoxigenin(미국 Oncor사) 20 μl에 37℃에서 5분간 처리 후 1X 인산완충액으로 37℃에서 2분간 3회 세척한 후, 조직 슬라이드를 PI/antifade(PI 농도 0.3 μl/ml)로 대조 염색을 실시하고, 22×50 mm 유리 덮개를 덮어 형광 현미경하에서 관찰하였다.
형광 현미경하에서 3개 이상의 형광 신호를 보인 핵들이 군집을 이룬 조직을 증폭을 보인 조직으로 분류하였으며, 대부분의 핵내에 2개 이하의 형광 신호를 보인 조직은 음성으로 분류하였다(Figs. 1, 2 and 3).
Dot blot hybridization법에 의한 연구
대상 및 조직
두경부 편평세포암종으로 진단된 14례의 환자로 이들은 부위별로 후두암이 5례, 구강암 4례, 구인두암 3례, 하인두암 2례이었으며, 병기별 분포는 2기가 5례, 3기가 7례, 4기가 3례이었다. 술후 방사선 치료는 4례에서 시행하였다. 이들의 연령은 49세에서 67세로 평균 연령은 57세이었고, 성별로는 남자가 12례, 여자가 2례이었다.
1례를 제외한 13례의 환자가 흡연의 기왕력이 있었으며, 흡연량은 15에서 84 pack-years였고 평균은 47 pack-years였다. 수술은 다양한 방법으로 시행되었으며 수술시 종양의 중심부와 절제연에서 조직학적으로 정상인 점막을 채취하여 -70℃에서 보관하였다.
실험 방법
-70℃에 동결된 조직을 1 ml의 digestion buffer(50 mM Tris-HCl pH 8.5, 1 mM EDTA, 0.5% SDS, 200 ug/ml proteinase K) 내에서 tissue tearor를 사용하여 조직을 갈아 섞고, digestion buffer에 섞인 조직을 500 μl를 취하였다. 채취된 검사물 (specimen)에 2.5 μl의 proteinase K (20mg/ml)를 첨가, 혼합하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 검사물을 원심분리하여 상층액을 취하여 동량의 phenol-chloroform-isoamyl alcohol(25：24：1)을 첨가하여 상층액을 원심분리하였다. 상기의 처리 과정은 2회 실시하였다.
100 μl의 TE-buffer로 재처리한 후, 1/10 volume의 100% 에탄올을 첨가하여 -20℃에서 침전시켜 원심 분리하였다. 검사물에 70% 에탄올 500 μl를 첨가하여 원심 분리한 후 상층액을 제거한 DNA pellet를 20 μl의 TE-buffer에 녹여 냉동 보관하였다.
정상 인체 백혈구에서 추출한 DNA를 사용하여 int-2 유전자의 exon 2의 염기 서열중 5' GCA GAC TGA GGA GCC TCC CA 3'과 5' TGG GAG GCT CCT CAG TCT GC 3'의 primer를 사용하여 684개의 염기서열을 가진 PCR산물을 얻어 아가로스겔(agarose gel)에 전기영동하여 겔에서 PCR산물을 DAEA-cellulose membrane을 이용 채취하여 정화하였다. 정화된 PCR산물은 DIG labeling kit(미국 Biomed사)를 사용 random priming의 방법으로 digoxigenin을 부착하였다.
Spectrophotometry로 정량한 검사물(DNA) 20 μg을 제한효소(restriction endo-nuclease) EcoRI으로 처리한 후 검사물을 끓는 물에 5분간 넣어 denaturation시킨 후 얼음에 식혔다. 검사물을 음압(vaccum suction)하에서 10 μg씩 점적하여 nitrose-celluose membrane에 흡착시켰다. Prehybridization 용액(50% formamide, 5% Denhart's solution, 5% SSPE, 0.5% SDS) 30 ml와 carrier DNA(salmon sperm DNA, 100 μg/ml)를 섞은 용액에 DNA를 흡착한 nitrose-celluose membrane을 넣고 42℃에서 1시간 동안 prehybridization을 실시하였다. Prehybridization solution에 0.08 μg/μl의 digoxigenin을 부착한 probe를 첨가하고 끓는 물에 3분간 넣어 denaturation을 실시하고 42℃에서 hybridization을 실시하였다. 0.1% SDS가 함유된 2X SSC 용액에 실온에서 5분간 2회 세척 후 0.1% SDS가 함유된 0.1X SSC 용액에 50℃에서 15분간 2회 세척하였다.
Maleic acid buffer(0.01M maleic acid, 0.015M NaCl, pH 9.5)와 1% blocking agent를 섞은 용액에 antidigoxigenin-alkaline phosphatase conjugate를 1：1000으로 용해하여 30분간 반응시키고, maleic acid buffer로 15분간 2회 세척한 후, detection buffer(0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9.5)에서 20℃에서 2분간 처리하였다.
Color substrate solution(detection buffer 10ml, NBT solution 45 μl, X-phosphate solution 35 μl)에 1시간 처리하여 발색하고, densitometry로 발색정도를 정량화하였으며 Merritt등7)의 방법에 따라 인체 백혈구 DNA의 발색 정도를 대조로 하여 대조에 비하여 2배 이상의 발색정도를 보일 때를 양성으로 판정하였다(Fig. 4).
결과
FISH법에 의한 int-2의 증폭 성적
대조군 12명(흡연 대조군 6명, 비흡연 대조군 6명)에서는 int-2의 증폭을 보인 예가 없었다. 두경부 편평세포암종 환자 20례 중 종양 조직에서는 11례(55%)에서 증폭을 보였으며, 인접 점막에서는 5례(25%)에서 증폭을 보였고 이들 인접 점막에서 증폭을 보인 5례는 종양 조직에서도 증폭을 보인 예들이었다. 부위별로는 구강암과 구인두암에서 각각 3례중 1례에서 종양 조직에서만 증폭을 보였으며, 하인두암에서는 3례 모두에서 종양 조직및 인접점막에서 증폭을 보였고 후두암에서는 10례중 6례에서 종양 조직에서 증폭을 보였으며 증폭을 보인 6례중 2례에서 인접 점막에서도 증폭을 관찰할 수 있었다. 그러나, 두경부 편평세포암종 환자의 협부 점막에서는 증폭을 보인 예가 없었다(Table 1, 2).
Dot blot hybridization법에 의한 int-2의 증폭 성적
두경부 편평세포암종 환자 14례에서 종양 조직에서는 대조에 비하여 2배에서 4배 int-2의 증폭을 보인 예가 5례(35.7%)였으며, 인접 점막에서는 2례(14.3%)에서 대조에 비해 2배의 증폭을 보였고 이들 인접 점막에서 증폭을 보인 2례는 종양 조직에서도 증폭을 보인 예들이다(Table 3, 4).
고찰
상부 기식도관에 발생하는 두경부 편평세포암종은 공중 보건에 심각한 위협을 주고 있으나 과거 20년간 수술 방법, 방사선 치료, 항암 화학요법의 발전에도 불구하고 두경부 편평세포암종 환자의 장기 생존율에는 괄목할 만한 증가가 없었다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 담배와 술과 같은 발암 물질에 노출되는 것을 줄이고 영양 상태를 호전시키는 등의 암 예방법 외에도, 암 발생의 가능성이 높거나 적극적인 국소 치료 후에 재발의 가능성이 높은 고위험군을 선별하여 화학 예방요법(chemoprevention)을 시행하는 것이 제시되고 있다.8) 실제 임상에서 13 cis-retinoic acid를 사용하여 구강내의 전암 병소(precancerous lesion)을 정상으로 환원시키거나 암으로의 진행을 억제하려는 시도와 두경부암 환자의 적극적인 치료 후 이차암(second primary cancer)을 예방하려는 시도 등이 있었다.9) 이상적인 화학 예방요법을 시행하려면 종양의 형성 과정에 대한 기본적인 이해와 함께 고위험군에 속해 있는 환자를 선별해 낼 수 있거나 화학 예방요법을 통한 종양의 억제나 환원 과정을 인지할 수 있는 생체 표지자(biomarker)의 이용이 요구되어진다.3)
이 연구에서 흡연자에서 암 발생의 가능성이 높은 고위험군을 선별하는 생체 표지자로서의 가능성을 찾고자 하는 것이 하나의 목적으로 흡연자 및 비흡연자의 협부 점막에서 FISH로 int-2의 증폭을 관찰하였으나 흡연자 및 비흡연자 모두 int-2의 증폭이 없었다. 그러나 대상군의 수가 적어 int-2의 증폭이 흡연자에서 암 발생의 가능성이 높은 고위험군을 선별하는 생체 표지자로서 역활은 확인할 수 없었으며 앞으로 이분야에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
정상 세포가 변형 세포로 전환되고 암으로 진행되는 과정에서 암 세포는 성장과 증식을 무한정 가능케 하는 유전자적 결손(genetic defects)을 획득하여야 한다.10) 처음으로 전환된 세포는 단일 클론이지만 종양이 진행하면서 여러 아클론(subclone)이 생성되므로 사람의 충실성 종양(solid tumor)은 동일한 종양 조직 내에서도 부위 별로 표현형(phenotype)과 유전형(genotype)이 다른 이질성(heterogeneity)을 갖게 되므로,11) 종양의 유전적 기초(genetic basis)를 이해하려면 종양의 전체적인 유전적 양상을 파악하여야 한다. 이러한 이유로 인체 고형암(solid cancer)의 연구에 있어 세포주(cell line)를 이용한 연구 외에 종양 조직을 이용한 연구가 강조되고 있으며, 특히 생체 표지자를 찾는 연구에 있어서는 종양 조직을 이용하고 동시에 형태학적 소견과 연계하는 기법이 강조되고 있다.
두경부 편평세포암종은 영역 암발생 기전에 의해 기식도관 점막의 어느 부위에서도 다발암이나 이차암이 발생할 수 있으며 이는 다단계의 발암(multistep carcinogenesis)과정을 거쳐 일어나게 된다. 다단계의 발암과정동안 특정 유전자의 증폭, 염색체의 삭제(deletion) 또는 전위(translocation)등이 일어나 발암 유전자(oncogene)를 활성화 시키거나 종양 억제유전자(tumor suppressor gene)를 비활성화등 유전학적 변화의 축적에 의해 암이 발생하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이런 특정 유전자의 변이가 특정 조직의 증식, 분화, 세포 소실 및 침윤에 어떠한 직접적인 영향을 주는지에 관하여는 충분한 연구가 이루어 지지 않은 상태이다. 종양에서 발암 유전자 또는 암 억제 유전자의 변화를 연구하는 기법으로는 종양에서 DNA를 추출하여 점변이(point mutation) 또는 증폭을 확인하는 기법을 주로 사용하여 왔으며,12) 이 연구에서도 동결한 종양 조직 및 인접 점막에서 DNA를 추출하여 dot blot hybridization을 실시하였다. 그러나 이러한 방법들은 종양 조직이나 인접 점막 외에 백혈구를 비롯한 다른 조직의 DNA가 혼합되게 되며 실제 종양의 핵내의 DNA의 양상을 파악하기에는 미흡하다. 최근 분자생물학적 기법의 발전으로 조직 절편 내에서 암유전자의 증폭 양상을 형태학적 소견과 연계하여 관찰이 가능한 fluorescence in situ hybridization(FISH)이 개발되어 이를 이용하면 세포 배양을 이용한 중기(metaphase) 핵 뿐만 아니라 간기(interphase) 핵에서도 암유전자의 증폭을 확인할 수 있게 되었다.
이렇게 FISH로 관찰할 수 는 암유전자는 증폭의 기전으로 암의 발생 및 진행에 영향을 미치는 int-2, Her-2/neu, myc, hst-1, bcl-1, ccnd-1 및 ems-1 등이 있다.13) 본 연구에서는 dot blot hybridization 외에도 int-2 유전자의 증폭을 FISH로 조직 내의 핵에서 관찰함으로써 형태학적 소견과 연계하는 연구를 시행하였다. 두 가지 기법 모두에서 일부 환자의 종양과 인접 점막에서 int-2의 증폭이 관찰되었으며 인접 점막에서 int-2의 증폭이 관찰된 예는 종양에서도 int-2의 증폭이 관찰 된 예로 유사한 결과를 얻었다. 그러나 두 가지 기법의 대상 환자들이 서로 다른 환자군들로서 dot blot hybridization과 FISH의 기법상의 차이 즉, 발현의 검출율(detection rate)을 비교하는데는 무리가 있으나 F-ISH의 방법이 조직내 종양세포나 상피세포내의 int-2의 증폭을 확인할 수 있어 임상에서 보다 쉽게 접근이 가능한 방법으로 생각되었다.
int-2는 쥐에서 유방암 바이러스에 의해 유방암을 유발시킬 수 있는 전구 암유전자중의 하나로 알려진 후 쥐의 정상세포에는 존재하지 않으나 발생학적으로 태아 초기에만 표현되는 유전자로서 태아의 세포성장에 관여할 것으로 추정하였다.14) 사람에 있어서는 bcl-1, hst 유전자와 함께 염색체 11q13에 위치하는 것으로 생물학적 작용기전은 정확히 밝혀져 있지 않으나 hst와 함께 섬유모세포 성장인자군(fibroblast growth factor family)과 유사한 유전자를 가지고 있어 혈관 신생(angiogenesis)을 촉진하고 세포의 노쇠화를 방지하는 역할을 할 것으로 추정하고 있다.15)
두경부암에서 염색체 11q13의 증폭은 예후와 상관 관계가 있는 것으로 보고하였으나,16) 구강암에서는 염색체 11q13의 증폭이 되는 경우가 적다고 발표하였다.2) int-2의 증폭은 유방암,17) 흑색종,18) 식도암19)등에서 관찰되었으며, 또한 int-2의 증폭이 국소 재발 및 원격전이와 상관관계가 있다고 보고하였다.20) 두경부 편평세포암종의 다단계 발암과정에서는 암외에도 암전구증에서도 증폭이 있음이 밝혀졌다. 이러한 이유로 본 연구에서는 int-2의 증폭을 두경부 편평세포암종 환자의 종양 조직 이외에 종양의 인접 점막과 협부 점막에서 관찰하여 int-2 증폭이 두경부 편평세포암종의 적극적인 국소 치료 후 이차암 또는 국소 재발의 표지자로 가능성이 있는지를 규명하고자 하였다. 이 실험의 결과 종양의 발생부위별 혹은 병기에 따른 int-2의 증폭의 발현률은 대상군의 수가 적어 통계학적으로 비교하기 어려웠으나 종양 조직에서 int-2의 증폭이 관찰된 환자의 일부에서는 인접 점막에서도 int-2의 증폭을 보였다. 이러한 소견은 종양 형성의 다단계의 발암과정 및 영역암 발생 또는 클론 확산의 개념을 뒷받침 하는 소견으로 생각되며 암 환자의 종양에 인접한 병리조직학적으로 정상인 점막에서 int-2의 증폭은 두경부 편평세포암종의 적극적인 국소 치료 후 이차암 또는 국소 재발의 가능성이 높은 고위험군의 선별에 이용할 수 있는 생체 표지자로의 가능성이 있어 향후 이에 대한 임상적 추적과 연계하는 연구가 필요하리라 생각된다.
결론
두경부 편평세포암종 환자의 종양조직에서 FISH와 dot blot hybridization을 이용하여 int-2의 증폭이 관찰된 일부 예에서 종양에 인접한 병리조직학적으로 정상인 일부 점막에서도 int-2의 증폭이 동시에 관찰된 예가 있은 것으로 보아 두경부 편평세포암종 환자에서 int-2의 증폭을 관찰함으로써 종양 조직과 인접 점막에서 int-2 유전자의 변화를 알 수 있으며 이러한 int-2의 증폭이 관찰된 환자들을 대상으로 전향적 연구를 실시하여 추적 관찰하면 int-2의 증폭과 치료 후 이차암의 발생 또는 국소 재발 등 임상 결과간의 관계를 확립할 수 있을 것으로 생각된다.
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