| Detection and Subtyping of Humam Papillomavirus in Laryngeal Cancers. |
| Dong Il Sun, Min Sik Kim, Jae Hong Cho, Young Hak Park, Seung Ho Cho |
| Department of Otolaryngology-HNS, The Catholic University of Korea College of Medicine, Seoul, Korea. |
| 후두암에서의 인유두종 바이러스의 검출과 아형분류 |
| 선동일 · 김민식 · 조재홍 · 박영학 · 조승호 |
| 가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
후두암ㆍ인유두종바이러스. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Mounting evidence suggests that human papillomavirus (HPV) might play an etiologic role in head and neck cancers. Both epidemiologic and molecular data support that certain types of HPV, such as HPV-16,-18 are associated with specific clinical and pathological characteristics and these are classified into high risk group. The aims of this study were to analyze the relationship between the presence of HPV in tissues from patients with laryngeal cancer and clinicopathologic characteristics.
MATERIALS AND METHODS:
HPV was detected in 39 laryngeal cancer specimens and 12 cervical lymph node tissue by polymerase chain reaction (PCR). To identify the types of HPV, positive results specimens were examined by PCR with HPV-16,-18 E6 type specific primer.
RESULTS:
HPV was detected in 9 cases (23.1%) among the 39 laryngeal cancers. Detection rate was higher in the tumors that infiltrate less than 1cm to the parenchyme (p=0.032).
HPV-16 was detected in 5 cases (12.8%), HPV-18 in 1 case (2.6%). In cervical lymph node, HPV was found not only in histologically positive nodes (22.2%), but also in histologically negative nodes (33.3%).
CONCLUSION:
The results of this study suggest that types of HPV have no relationship with clinicopathologic parameters and that HPV play a role not only in the early stage tumorigenesis but also in the cervical lymph node metastasis. |
| Keywords:
Laryngeal cancerㆍHPV-16, -18ㆍTumorigenesis |
서론
인체의 종양 발생과 연관이 있는 종양바이러스중 인유두종 바이러스(humam papillomavirus：이하 HPV)는 주로 자궁경부암에서 연구되어 왔으며 자궁경부암의 80~90%에서 분자생물학적 방법으로 HPV가 검출되어 자궁경부암의 주요 발병원인으로 제시되고 있다. 또한 병소의 위치와 병변의 진행과정에 따라 서로 다른 HPV 아형이 선택적으로 발견되는데,1) HPV-16, -18은 주로 자궁경부의 상피내 종양과 침윤성 자궁경부암에서 발견되고,2) HPV-18이 검출된 자궁경부암의 경우 HPV-16이 검출된 군이나 HPV DNA가 검출 되지않은 군에 비해 예후가 불량한 것으로 알려져 있다.3) 또한 HPV DNA가 림프절에서 검출된 경우 재발의 빈도가 높고 치료에 대한 반응과 예후가 좋지않다고 한다.4) 이와 같이 자궁경부암에서 HPV와 임상양상과의 관계는 비교적 자세히 연구되어 왔다.
두경부 영역에서도 HPV-6, -11등이 후두유두종등 상기도에 발생하는 양성 종양의 주된 발병 원인으로 알려져 있고5) HPV-16은 설암, 설근부암6) 및 후두의 우췌양암(verrucous cancer)7)등의 두경부종양의 발생과 관련이 있다고 알려져 있으나 종양 발생에 있어서의 역할이나 그 의의에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
저자들은 후두암 환자의 원발부위 암조직과 경부림프절조직을 대상으로 PCR(polymerase chain reaction)을 시행하여 HPV DNA의 검출 및 HPV-16, -18의 아형을 분리하고 후두암의 임상적, 병리학적 소견과의 상관관계를 알아 보고자 본 연구를 시행하였다.
재료 및 방법
재료
1993년 5월부터 1996년 11월까지 가톨릭대학교 의과대학 부속 강남성모병원 이비인후과에서 후두편평세포암으로 후두적출술을 시행받고 1년이상 경과되었거나 또는 1년내 사망한 경우는 사망시까지 추적 관찰이 가능하고 평균 추적관찰 기간이 24.8개월인 39명의 환자를 대상으로 하여 HPV DNA검출과 아형분류를 시행하였다. 환자 연령은 45세에서 76세로 평균 61.3세였고 모두 남자였다. 이중 경부 림프절 조직을 얻을 수 있었던 경우는 12례이었으며 수술시 채취한 암종조직을 -70℃에 신속히 냉동 보관 한 후 실험에 사용하였다.
병리 조직학적 분류
후두암 환자 39명의 병리학적 병기, 발생 부위, 조직학적 분화도, 주위 조직의 침투 형태, 실질 조직내의 침윤깊이, 림프관이나 혈관내 침윤 및 경부 림프절 전이 유무 등을 조사하였고 환자의 병기는 American Joint of Cancer Committee(1992)의 분류 방법을 사용하였다.
DNA의 추출
DNA의 추출은 -70℃에 냉동 보관된 후두암종과 경부림프절조직에서 DNA추출 kit(InstaGene Matrix, BioRad Laboratories, U.S.A.)를 이용하였다. 먼저 3 mg의 조직을 잘게 잘라 1.5 ml microcentrifuge 시험관에 넣고 세포용해용액을 첨가하여 원심분리하고 상층을 깨끗이 제거한후, 1×PBS buffer 1 ml를 넣어 다시 원심분리하였다. 3차 증류수와 세포부유액을 각각 20 μl씩, kit시약 Insta-Gene matrix 200 μl를 넣어 56℃에서 15~30분간 처리하였다. 시험관 바닥에 굳혀진 소량의 조직이 풀어질 만큼 vortex로 섞어준 뒤 남아 있는 단백질의 비활성화를 위해 100℃에서 8분간 처리하고 재부유 시킨후 원심 분리하여 상층액 5 μl씩을 PCR에 이용 하였다.
중합 효소 연쇄반응
HPV DNA의 증폭은 Manos등 8)이 고안한 L1 open reading frame중 450bp를 증폭할 수 있는 L1 consensus primer를 이용하였다. HPV DNA가 검출된 경우에는 HPV-16, -18의 아형을 알아보기 위하여 한국 생명 공학 연구소의 주문 합성한 206 bp로 증폭되는 HPV-16 E6 type specific primer와 419bp로 증폭되는 HPV-16 E6 type specific primer를 PCR에 이용하였다(Table 1). PCR은 추출된 DNA 5 μl에 0.2 mM의 각 dNTP들, PCR buffer 10×concentration 10 μl, 0.5 mM의 consensus primer, 2.5 unit의 Taq polymerase(Boehringer manheim, Germany)와 증류수를 섞어 총 100 μl의 양이 되도록 하였다.
Thermal cycler(Perkin-Elmer, USA)에서 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분간의 처리과정을 40회 반복하였다. 양성대조군으로 HPV-16, -18, -31 DNA 5 μl를 표본 DNA로, 음성대조군으로는 조직 대신 증류수와 반응액을 혼합한 것을 각각 사용하였다.
증폭 산출물중 10 μl를 2% agarose gel(Boehrnger manheim, Germany)에서 전기영동(80 volts에서 5분, 120 volts에서 45분)한 후 0.5 μl/ml 농도의 ethidium bromide(Boehringer manheim, Germany)용액으로 30분간 염색하였다. 양성 결과로 나온 검체를 HPV-16, -18 E6 primer를 이용하여 같은 방법으로 증폭하여 아형을 분리하였다.
자료분석과 통계처리
자료의 유의성 검정에서 HPV DNA 검출 유무와 발생 빈도의 차이는 X2-검정을 이용 하였고, 표본수가 적은 경우에는 Fisher’s exact test로 하였다. 유의성 검정에서 유의 수준을 p<0.05 범위로 정하였다.
결과
후두암에서 HPV DNA의 검출과 아형분류
PCR의 산물을 전기영동한 결과 HPV DNA는 39명의 후두암 환자중 9명(23.1%)에서 검출 되었다(Fig. 1). HPV DNA가 검출된 9례를 type specific primer를 이용하여 증폭하여 전기영동한 후 206 bp 크기의 HPV-16형 DNA band와 419 bp 크기의 HPV-형 DNA band를 검출하였다(Figs. 2 and 3). HPV-16형은 5례(12.8%), HPV-18형은 1례(2.6%)로 HPV-16형과 동시에 검출되었던 경우였으며 HPV-16,-18 이외의 형은 4례(10.3%)였다. HPV DNA와 임상병리학적요인과 관계를 살펴보면 병리학적으로 조기암에서 50%로 진행암에서의 검출율 20% 보다 높았으며 경부 림프절 전이가 없는 경우에 33.3%로 전이가 있는 경우의 14.3%보다 높았으나 통계적 유의성은 없었다. 후두실질내의 암 침투 깊이가 1 cm 미만인 경우가 1 cm 이상의 경우보다 통계적으로 유의하게 높았으며(p＝0.032), 기타 다른 조직학적 특징에 따른 HPV DNA 검출 빈도는 유의한 차이가 없었다(Table 2). HPV 아형에 따른 임상병리학적 특징은 HPV-16, -18형은 주의의 림프관이나 혈관에 침윤이 있는 경우와 경부 림프절 전이가 있는 경우에 각각의 없는 경우보다 검출 빈도가 높았으나 통계학적 유의성은 없었다(Table 2).
경부 림프절에서 HPV DNA의 검출
경부청소술로 림프절 조직을 얻을 수 있었던 12례중 3례(25%)에서 HPV DNA를 검출할 수 있었고 림프절의 조직학적 전이 유무에 따른 HPV DNA의 검출은 병리학적으로 전이가 있었던 림프절(22.2%)과 전이가 없었던 림프절(33.3%)에서 검출 되어 양성 및 음성 림프절 모두에서 검출되었다(Table 3). 한편 원발부위의 HPV DNA 검출 유무에 따른 림프절에서의 HPV DNA 검출율은 원발부위에 HPV DNA가 검출된 경우가 6례중 2례(33.3%)로 원발부위에 HPV DNA가 검출되지 않으면서 림프절에서 검출된 경우 보다 높았으나 유의성은 없었다(Table 4).
재발암과 HPV의 관계
수술후 후두암의 재발은 39례중 11례(28.2%)에서 있었는데 HPV DNA가 검출된 9례에서는 3례(33.3%)가 재발하였고, 검출되지 않았던 30례에서는 9례(26.7%)에서 재발하여 HPV DNA검출과 재발과는 유의한 상관은 없었다(Table 5).
고찰
암은 종양 바이러스, 방사선 또는 화학적 발암물질들에 의해 세포내의 유전자 이상이 발생함으로써 정상 세포가 암세포로 변형되어 나타나는 비정상적인 세포 성장의 결과이다. 자궁경부암을 비롯한 신체에 발생하는 여러 종양들과 연관이 있다고 알려진 HPV가 세포내로 감염되는 것이 복잡한 암 발생의 한 단계로 간주할 수 있다.
HPV는 60여종의 아형이 있으며 약 8000 base pair를 갖는 이중나선 구조의 DNA 바이러스로 우리몸의 상기도에 잠복 감염 형태로 존재하다가 어떤 요인에 의해 활성화되어 암발생에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 병소의 위치와 병변의 진행과정에 따라 HPV의 다른 아형이 검출되어 HPV-6, -11은 주로 비현성 감염이나 후두 유두종 같은 양성 질환을 유발하며 HPV-16, -18, -31, -35, -51형은 자궁경부 및 비뇨기계의 악성 종양인 편평 상피암과 연관이 있다. 두경부 영역은 해부학적 특성상 점막이 외부로 직접 노출되므로 HPV에 감염될 가능성이 많으며 HPV 감염에 의해 두경부 점막 여러 부위에 유두종등이 발생하거나 잠복감염의 형태로 남을 수 있다. HPV가 두경부암의 발생과 연관이 있다는 것은 후두암,9) 설암,10) 편도암,11) 등 여러 부위에서 연구되어 왔으나 이들이 예후 인자로 작용할 수 있는지에 관해서는 별로 알려진 바가 없다.
두경부 편평 세포암에서 HPV의 검출은 설암의 18%, 편도암의 29%, 인두암의 13%, 후두암의 5% 등으로 보고 하고 있는데,6) 검출 빈도는 검출 방법, 조직 채취 방법의 차이 및 검사방법의 특이도와 민감도가 다르다. 후두암에서도 PCR을 이용한 경우 20.6~54% 등으로 보고자에 따라 결과가 다양하다.12)
본 연구에서 HPV DNA의 검출 빈도는 39명의 후두암 환자중 23.1%인 9명에서 검출되었는데 같은 동결조직을 이용한 Morgan등의13) 40%보다는 낮았다. HPV DNA가 검출된 군의 임상적 특징을 보면 60세 이후에 발생한 군에서 많이 검출되어 젊은 군에서 HPV DNA가 더 많이 검출되었던 Hoshikawa의 보고와 일치하지 않았다.14) HPV DNA의 검출은 병기별로는 조기암인 I, II기 후두암에서 50%에서 나타나고 진행암인 III, IV기 후두암에서는 20%가 검출되어 조기암에서 더 많이 검출되었으나 통계적으로 유의하지는 않았다. 또한 림프관이나 혈관의 침윤이 없는 경우, 경부 림프절 전이가 없는 경우에 있는 경우보다 검출율이 높았으며 후두 실질 조직내로 종양의 침투가 1 cm 미만인 경우가 1 cm 이상인 경우보다 유의하게 HPV DNA가 많이 검출되어 이들이 조기암에서 진행암에 비해 HPV DNA가 많이 검출되는 것과 연관이 있을 것으로 생각된다.
HPV에 의한 특징적인 변화는 주로 분화가 잘된 세포에서 일어나므로, HPV에 의해 유도되는 세포 병변은 완전 분화된 세포에서 주로 발생한다고 하였는데,15) 본 연구에서도 HPV DNA가 검출된 9예중 8예가 종양의 분화도가 중등도 이상의 분화도로 이는 Ishibashi등16)의 보고와 일치하였다. HPV 검출 빈도를 해부학적 위치별로 보면 성대암에서 성문상부암에서보다 발생 빈도가 높아 성대암 환자 44.4%에서 HPV DNA가 검출되어 HPV 감염이 성대암 발생과 관련이 있을 것이라고 했던 Hoshikawa등의 보고와 일치하였다.14)
HPV는 병소의 위치와 병변의 진행과정에 따라 특이한 아형이 선택적으로 발견되는데 HPV 아형중 HPV-16, -18형은 고위험군의 자궁 경부암과 연관이 있다고 알려져 있다. 그러나 자궁경부암에서와는 달리 두경부 종양에서는 아형에 따른 병리학적 특징은 알려진 바가 없다. HPV-16형의 검출 빈도도 두경부 종양에서 보고자에 따라 다양하게 알려져 있다. 본 연구에서는 HPV-16형이 12.8%에서 검출되어 Kiyabu,17) Hoshikawa등14)의 후두암에서의 검출율 40%, 17.6%보다 낮았다. HPV-16형의 발생 부위별로는 성문상부암에서 19례중 3례에서 검출되어 14례중 1례가 검출된 성문암보다 검출 빈도가 높아 성문암에서 HPV-16형 검출빈도가 44.4%로 높았던 보고와는 일치하지 않았으나14) 이는 성문암의 증례가 성문상부암보다 적었던 것에 기인하리라 생각된다. 병리학적 요인에 따라서는 HPV-16형은, 림프조직이나 혈관내 침윤이 있는 경우, 경부 림프절 전이가 있는 경우에 검출 빈도가 높은 경향을 보였다. 즉 HPV-16형은 HPV-16, -18이외의 아형보다 종양의 예후가 나쁜 경우에 검출빈도가 높았으나 통계적 유의성은 없었다. HPV-18형은 자궁경부암에서 HPV-16형이 검출된 군이나 HPV DNA가 검출 되지 않은 군에 비해 사망율이 높고 상피내 종양 보다 침윤암에서 검출 빈도가 높으며 암전구 병소에서 오래 머물지 않고 빨리 침윤암으로 진행되는 것으로 알려져 있다.3) 또한 조기 자궁경부암에 있어도 HPV-18이 검출된 경우 재발을 잘하여 예후가 나쁘다고 알려져 있다.4) 두경부 종양에서 HPV-18형의 검출 빈도는 낮아 설암에서 3%정도의 검출율을 나타낸다.18) 본 연구에서도 HPV-18형이 2.6%인 1예에서만 검출되었고 수술후 3년이 경과 한 상태로 현재 재발의 징후는 보이지 않고 있다. 앞으로 HPV-16, 18형의 임상병리학적 특징을 밝히기에는 좀 더 많은 증례의 연구와 추적 관찰이 필요할 것으로 생각되었다.
경부 림프절에서 HPV DNA의 검출은 원발부위에서 HPV DNA가 검출된 6례에서는 2례, 검출되지 않은 6례에서는 1례가 검출되었다. 후두암 원발부위는 물론 경부 림프절에서도 HPV DNA가 검출되는 것은 HPV가 악성 형질변화과정이나 경부전이과정에 중요한 역할을 한다는 증거가 될 수 있다고 하겠다. 19) 그리고 원발부위에 HPV DNA가 검출된 4례에서 림프절에서는 HPV DNA가 검출되지 않았는데, 이는 HPV가 후두암 발생초기에 역할을 하며 일단 악성화된 세포에는 종양의 진행에 HPV가 필요 없다는 hit and run기전20)으로 설명할 수 있다.
두경부암은 임상소견중 경부 림프절 전이의 유무가 예후에 중요하므로 수술시 얻은 림프절에서 HPV DNA를 검출하여 전이 유무를 결정할 수 있으면 치료 방침 결정에 도움을 줄수 있을 것이다. 본 연구에서 병리학적으로 음성인 림프절에서도 HPV DNA가 검출된다는 것은 병리학적으로는 아직 음성이나 생물학적으로는 악성화된 세포의 조기 전이에 HPV가 관여한다고 가정할 수도 있으나 중합효소연쇄반응은 면역세포에 의해 탐식된 극미량의 HPV도 검출할 수 있기 때문에 HPV DNA의 존재가 림프절의 전이를 조기에 확실하게 진단할 수 있는 방법은 아니다.
후두암의 예후와 관련이 있는 국소 또는 경부의 재발과 HPV의 관련에 관하여는, HPV가 두경부 종양의 재발이나 이차암의 발생과 연관이 있을 수 있다고 알려져 있다.18) 본 연구에서도 HPV DNA가 검출된 경우에 33.3%가 재발하여 검출되지 않은 경우의 26.7%보다 높아 후두암의 재발에 HPV가 연관이 있을 수 있다고 추정되어 수술후 후두암 조직이나 경부림프절에서 HPV가 검출되면 방사선치료 등의 보다 적극적인 치료계획을 세울 수 있는 예후인자로서 HPV가 이용될 수 있을 것으로 생각 되었으나 향후 많은 연구가 필요할 것으로 생각되었다.
결론
저자들은 1993년 5월부터 1996년 11월까지 가톨릭대학교 의과대학 부속 강남성모병원에 내원했던 후두암 환자 39명의 후두암 조직과 전이된 경부 림프절 조직을 얻을 수 있었던 12명에서 중합효소연쇄반응 방법을 이용하여 HPV DNA를 검출하고 임상양상과의 관계를 분석하고 HPV DNA가 검출된 경우에 악성종양과 연관이 있다는 HPV-16, -18을 검출하여 이들과 임상병리학적 인자와의 관계를 알아 보았다. HPV DNA는 후두암 환자 39명중 9명(23.1%)에서 검출되었고 병리학적 요인에 따라서는 종양의 실질조직내 침범이 1 cm 미만인 경우 통계적으로 유의하게(p＝0.032) 높게 검출 되어 조기암에서 높은 수준으로 검출되는 경향을 보였다.
HPV가 검출된 경우에 그 아형으로는 HPV-16형이 가장 많았다. 경부림프절에서는 12례중 3례(25%)에서 검출되었고 병리학적으로 전이가 있었던 림프절 뿐 아니라 없었던 림프절에서도 검출되었다.
이와 같은 결과에서 HPV는 후두암 발생의 초기에 관여하며 경부림프절전이에 관여한다고 추정할 수 있으나 종양 발생에서의 역할을 밝히고 예후인자로서의 이용되기까지는 많은 증례의 연구와 추적 관찰이 필요할 것으로 생각된다.
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