Preventive Effect of Fosfomycin on Cisplatin Induced Ototoxicity in Cochlea of Guinea Pig.

Kim, Chun Dong; Byun, Sung Wan; Chung, Won Ho; Kim, Chong Sun

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(2); 1998 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(2): 168-173.

Preventive Effect of Fosfomycin on Cisplatin Induced Ototoxicity in Cochlea of Guinea Pig.

Chun Dong Kim, Sung Wan Byun, Won Ho Chung, Chong Sun Kim

¹Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Seoul National University, Korea. cdkim007@choclian.net
²Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Ewha Womans University, Seoul, Korea.

기니픽에서 Cisplatin 이독성에 대한 Fosfomycin의 예방적 효과

김춘동² · 변성완² · 정원호¹ · 김종선¹

서울대학교 의과대학 이비인후과학교실1;이화여자대학교 의과대학 이비인후과학교실2;

주제어: 이독성ㆍ씨스플라틴ㆍ포스포마이신.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The use of cisplatin as a therapeutic drug in malignant neoplasm is known to have associated side effects such as nephrotoxicity and ototoxicity. Although the nephrotoxic effect of this drug can be somewhat decreased by use of the hydration method, prevention of the ototoxic effect, which is known to induce irreversible change on the cochlea, has not been well established. The purose of this study is to evaluate the preventive effect of fosfomycin in cisplatin induced ototoxicity. METHODS: Fosfomycin was used to reduce the ototoxic effects of cisplatin, and its efficacies were evaluated anatomically as well as physiologically. Anatomically, a histologic study of cochleas was carried out by scanning electro-microscopy, and physiologically, cochlear microphonics and compound action potentials were studied in guinea pigs.
RESULTS:
Protection against distortion and loss of outer hair cells in the basal turn of cochlea caused by cisplatin was found to be statistically significant in the groups injected with fosfomycin.
CONCLUSION:
Fosfomycin was found to be effective in providing protection against cisplatin induced ototoxicity.

Keywords: OtotoxicityㆍCisplatinㆍFosfomycin

서론 두경부종양의 항암제 치료로 널리 쓰이는 cisplatin은 환자들의 생존률의 현저한 증가를 가져온 반면 치료후 그 부작용으로서 신독성, 말초신경병증과 이독성이 일시적 혹은 영구적 문제로 대두되고 있어 환자에 쓰는 용량이 어느정도 제한되고 있다. 이것은 악성종양환자의 치료에 있어서 암세포에 대한 근치적치료와 환자의 수명을 연장시키는 노력과 함께 암환자의 삶의 질을 증가시키기 위해 치료시 발생되는 부작용을 어떻게 치료하고 그 발생률을 줄일 수 있느냐 하는 문제를 고려해야 하며 cisplatin의 용량을 증가시키면 암의 치료에 유리한 점이 있으나 그 부작용도 커짐을 의미한다. Cisplatin에 의한 신독성은 수액요법과 이뇨제요법을 통해 어느정도 예방이 가능하고 발생률도 감소하였지만 cisplatin에 위한 이독성은 아직까지 치료방법이 확립되어 있지 않으며 와우의 비가역적 변화로 인하여 그 예방이 중요시 되고 있다. Cisplatin에 의한 이독성은 연구자에 따라 13%내지 81%에서 일시적인 또는 영구적인 감각신경성 난청이 보고되고 있어 그 발생률이 적지 않음을 알 수 있으며, 암환자의 삶의 질을 향상시키기 위해서는 이독성의 예방과 그 기전에 대한 연구의 중요성이 점차 증가되고 있다.1-4) 최근 cisplatin의 이독성을 감소시켜 주는 물질로 알려진 여러물질중 쉽게 구할수 있고 임상에서 많이 사용하고 있는 phosphoenol pyruvate transferase 억제제인 fosfomycin을 사용하여 기니픽에 cisplatin과 동시에 투여하였을 때 fosfomycin의 cisplatin 이독성에 대한 예방적 효과를 기니픽 와우의 기저부에서 주사현미경을 통한 형태학적 효과와 와우음전기반응(cochlear microphonics)과 복합유발전위(compound action potential)로 생리학적으로 관찰하여 fosfomycin의 cisplatin의 이독성에 미치는 효과를 비교하여 이독성 난청을 감소시킬 수 있는 치료방법이나 기전을 연구하는데 도움이 되고자 하였다. 재료 및 방법 대상 동물 고막 소견이 정상이고, 이개반사(Preyer’s reflex)가 양성인 건강한 수컷 흰색 기니픽 16마리(체중 320~420 g)를 이용하였다. 기니픽 8마리는 cisplatin 투여군(대조군)으로, 다른 8마리는 cisplatin과 fosfomycin 동시투여군으로 설정하였다. 약물의 투여 Cisplatin 투여군은 cisplatin(1 mg/ml, 보령제약)을 8 mg/kg 용량으로 천천히 복강내에 일회 주입하고 일주일 동안 주위에 물을 풍부하게 공급하여 탈수되지 않게 하였다. Fosfomycin 투여군은 cisplatin 8 mg/kg를 천천히 복강내에 일회 주입하고 같은날 fosfomycin 320 mg/kg를 천천히 복강내에 주입한 후 실험 7일째까지 매일 복강내로 fosfomycin만 320 mg/kg의 용량을 7회 투여하였다. 동물의 관찰 Cisplatin 투여군, fosfomycin 투여군은 각각 약물의 투여전에 와우음전기반응(cochlear microphonics)과 복합유발전위(compound action potential)를 측정하고 매일 체중 및 이개반사를 측정하였다. 실험 8일째에 마취후 와우음전기반응과 복합유발전위를 측정한 후 형태학적인 검사를 위한 조직 처리를 하였다. 체중의 상실이 심하여 더 이상 생존을 유지하기 힘들다고 판단된 동물은 실험 8일째가 되기 전에 조직 처리를 하였다. 실험동물 내이의 주사전자현미경 검사 실험동물을 xylazine hydrochrolide와 pentobarbital 40 mg/kg를 각각 복강내로 주사하여 마취한 후 흉부를 절개하여 심장을 노출시킨 후 좌심실을 절개하고 카테터를 상행 대동맥내로 삽입하여 이를 통해서 0.1% sodium nitri-te를 포함한 50 ml의 생리식염수로 두경부의 혈액을 세척한 후 2.5% glutaraldehyde를 서서히 주입시켜서 측두골을 생체 상태에서 고정한 후 양측 측두골을 얻었다. 측두골을 추출한 후 중이강을 노출시켜서 정원창, 난원창 및 와우첨단을 개방하고 이 부위들을 통하여 2.5% glutaraldehy-de를 내이로 유입시켜서 4℃에서 24시간동안 고정하였다. 고정한 측두골을 해부현미경하에서 pick와 드릴을 이용하여 와우의 전면골부를 제거하고 혈관조를 박리하여 Corti 기관을 노출시켰다. 이를 pH 4.0인 2% tannic acid로 24시간 처리한 후 2% osmium tetroxide로 2시간 후고정하였다. 고정된 표본을 70% 알콜에서부터 시작하여 100% 까지 점차적으로 농도를 높여가면서 탈수시킨 후 임계점건조기를 이용하여 임계점 건조시킨 후 이온도금기로 백금도금하고 주사전자현미경(Hitachi S-2460N)으로 기니픽 와우의 기저부를 관찰하였다. 청성뇌간유발전위검사 Xylaxine과 sodium pentobarbital을 복강내 주사하여 마취시킨후 청성뇌간유발전위검사를 시행하였다. 세 개의 침전극을 두정부(활성전극), 동측유양돌기부(음전극), 반대측 유양돌기부(접지전극)에 설치하였고 동측귀를 통하여 0.5 kHz, 1 kHz, 2 kHz, 4 kHz, 8 kHz, 10 kHz, 12 kHz, 14 kHz에서 와우음전기반응(cochlear microphonics)과 복합유발전위(compound action potential)를 측정하였다. 이 실험에 사용된 모든 음자극은 Macintoshi 컴퓨터에서 GW-Board(GW Inc.)를 이용해서 16 bit의 정밀도로 전산합성 되었다. 이때 합성 sample 주파수는 50 kHz로하여 사용되었다. 음압은 2개의 HP attenuator(HP Inc.)로 1 dB 간격으로 조정되게 시스템에 설치되었다. 초기신호는 Biophysical amplifier(VC-9, Nagashima Medical Inc.)로 증폭되었다. 만들어진 timing circuit을 통하여 전산합성된 자극과 와우음전기반응 및 복합유발전위 반응이 동기가 되고 계속하여 평균되게 하였다. 이때 와우음전기반응과 복합유발전위는 필요에 따라서 250번이상 평균되었다. 평균된 파형은 Tektronics digital oscilloscope(TDS360, Tektronics Inc.)로 표시되어 분석하였다. 결과의 평가 기준과 통계 처리 주사전자현미경 사진 상의 각 열(row)별로 유모세포의 수를 세고, Hultcrantz 등1)이 분류한 다음 4단계의 grade로 개개의 유모세포의 손상 정도를 평가하였다. grade 0：정상 grade 1：섬모의 stiffness 소실, 섬모중 50%이상이 정상 grade 2：섬모의 융합, 거대섬모의 출현, 섬모중 50% 이하가 정상 grade 3：섬모의 부재 결과의 정량적인 평가와 통계적인 검증은 Chi square for trend by Mantel extension method 법을 적용하였으며, 통계 소프트웨어는 개인용 컴퓨터 IBM-PC 호환 기종에서 동작하는 Epi Info(Version 5.00, Centers for Disease Control, Epidemiology Program Office, Atlanta, Georgia, U.S.A.)를 사용하였다. 결과 Cisplatin 투여군의 주사전자현미경 검사 소견 Cisplatin 투여군의 와우의 주된 이상 소견은 섬모의 왜곡변형, 경직성 상실, 탈락 등이 었으며 외유모세포 제일 바깥열인 제 3 열의 손상이 가장 많았으며 외유모세포의 2열, 1열, 내유모세포의 순으로 손상이 진행되었다(Fig. 1.). Cisplatin과 Fosfomycin 동시 투여군의 주사전자현미경 검사 소견 Cisplatin 투여군에서 보이는 와우의 주된 이상 소견인 섬모의 왜곡변형, 경직성 상실, 탈락 등을 볼 수 있었고 손상의 정도도 가장 바깥열인 외유모세포 제3열의 손상이 가장 많았으며 외유모세포의 2열, 1열, 내유모세포의 순으로 손상이 진행되었으나(Fig. 2) 와우의 위치에 따른 유모세포의 손상정도를 Chi square for trend by Mantel extension method 법에 의한 통계적 검정에 의하면 상대위험도(odds ratio)가 cispatin 군의 위험도를 1.0으로 보았을 때 fosfomycin 동시 투여군에서 기저부(basal turn)가 0.36으로 통계적으로 유의한 예방적 효과를 보여주었다(Table 1, 2). Cisplatin과 Fosfomycin 동시 투여군의 전기생리학적 검사 소견 Cisplatin 투여군에서 Fosfomycin 투여군에 비해 와우음전기반응과 복합유발전위의 약물투여 후의 역치상승이 높았고 와우음전기반응의 역치결과가 복합유발전위보다 더 높게 나타났으며 Fosfomycin투여 전에는 고주파수에서 20 dB내외의 역치상승이 나타났으나 Fosfomycin투여 후에는 고주파에서의 역치상승정도가 10 dB내외로 적어져 기저부에서의 역치가 가장 크게 영향을 받았다(Figs. 3 and 4). 고찰 항암제로 널리 사용되고 있는 cisplatin은 DNA에 비가역적으로 반응하여 guanine residue 사이에 intra-strand crosslink 를 형성하는 것으로 알려져 있는 강력한 항암제이다. 그러나, 이 약제는 이독성, 신독성 등의 부작용을 가지고 있다. 신독성은 항암치료시 수액요법과 이뇨제를 사용한 후로 그 발생률이 현저히 감소하였으나 이독성의 발생률에는 큰 변화가 없으며 손상의 정도도 비가역적인 변화이다. Cisplatin의 투여에 따른 이독성은 연구자마다 정도의 차이가 있어, Piel 등2)은 cisplatin 투여환자의 13%에서 난청이 생겼다고 하였고 Boheim과 Bichler3)는 cisplatin 투여환자의 48%에서 난청이 생겼다고 보고하였다. Rybak 등4)에 의하면 4000~8000 Hz이상의 음영역에서 양측성으로 발생하며 용량에 따를 축적효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한 Laurell 등5)6)의 연구에서는 81%의 환자에서 일시적인 난청이, 13%에서는 회복되지 않는 영구적인 난청이 생겼고, 이는 나이가 들수록 점점 심해지는 경향을 보였다. Blakley 등7)은 hemoglobin과 혈장단백질이 낮은 환자에게서 cisplatin 투여후 내이독성이 생길 가능성이 높다고 하였고, 환자의 나이와는 관련이 없다고 하였다. 그러나 Laurell 등은 나이가 증가할수록 이독성이 심하게 나타나며 Barr-Hamilton 등8)은 melanin 색소가 와우에 platinum을 retention시켜 독성의 위험도를 높임을 주장하였다.이와같이 cisplatin의 이독성은 발생률이 일시적이거나 영구적으로 13%에서 81%까지 많으며 그 위험인자도 여러 가지가 있다. Cisplatin에 의한 내이의 병리조직학적인 변화는 주로 와우의 변화에 국한되어 발생하며 와우에서는 코르티기관과 혈관조에 손상이 오고 유모세포의 손상정도는 와우의 기저부에서 첨부보다 심하고 외유모세포에서 내유모세포보다 손상이 심함은 잘 알려져 있다.2-4)6) 본 연구에서도 외유모세포의 손상이 내유모세포에 비하여 더 컷으며 기저부에서 간부에 비해 더 손상이 큰 것을 확인할 수 있었다. Cisplatin에 의한 이독성을 감소시키려는 노력은 cisplatin의 항암효과를 감소시키지 않는 물질로 신독성에 예방적인 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 이뇨제, fosfomycin, superoxide dismutase같은 유리산소 라디칼 제거제, diethyldithiocarbamate와 WR-2721, thiosulfate 같은 sulfur nucleophiles, quinine같은 base transport inhibitor 약제를 병용 투여하는 방법과 carboplatin 같은 cisplatin의 부작용이 적어진 비슷한 약제를 개발하는 방법으로 연구되어 왔다. Cisplatin의 이독성을 감소시키기 위하여 병용 투여 되는 여러가지 약제중 한가지인 fosfomycin(1,2-epoxypro-pylphosphonic acid)은 phosphoenol-pyruvate trans-ferase를 억제하는 phosphonic acid로 수용성이고 작은 분자량(138 dalton)을 가지며 혈장에 결합되지 않고 자유형태로 존재하는 물질로 CSF, 간, 골등 여러조직에 쉽게 들어 갈 수 있는 반면에 부작용은 거의 없는 약제이다. Neu-man9)에 의하면 fosfomycin이 aminoglycoside에 의한 신독성과 이독성을 억제하여 주는 것으로 알려져있다. Oh-tani 등10-12)에 의하면 혈관주사로 cisplatin과 fosfomycin을 병용투여 하였을 때 체중감소, 신독성, 이독성이 감소한다고 보고하였다. Krube 등13)에 의하면 perilymph에 fosfomycin이 들어가도 이독성이 없음을 보고하였고 Schweitzer 등14)15)에 의하면 fosfomycin 혈장치의 12%정도가 perilymph에 들어가며 반감기는 4.9시간으로 보고하였으며 fosfomycin과 cisplatin을 병용투여 하여도 항암효과에는 변화가 없고 신독성, 이독성 등의 부작용이 감소하여 cisplatin의 용량을 증가시켜 사용할 수 있음을 보고하였다. 본 실험에서도 기니픽에 cisplatin과 fosfomycin을 복강내로 병용투여 하였을 때 전자현미경을 통한 유모세포의 손상을 비교하였을 때 이독성이 cisplatin 단독 투여군의 위험률을 1.0으로 보았을 때 기저부가 0.36으로 2.7배의 이독성 감소를 보였다. 이 연구에서 기저부에서의 위험률만을 비교한 것은 주사현미경검사를 위한 조직의 준비시 대조 연구로 정상 기니픽을 가지고 주사전자현미경조직을 준비하였을 때 드릴이나 여러요소로 첨부의 유모세포는 손상을 받는 경우가 있어 기계적 손상의 요소를 배제하기 위해 기저부 만을 두 군에서 비교하였다. 전기생리학적검사는 cisplatin의 이독성이 고주파일수록 손상정도가 많았으며 fosfomycin을 투여하였을 때 그 손상정도가 와우음전기반응과 복합유발전위 모두에서 손상의 정도를 감소시킬 수 있음을 알수 있었다. 또한 와우음전기반응이 복합유발전위보다 손상의 정도가 크게 나타났는데 이것은 와우음전기반응이 복합유발전위보다 유모세포의 손상을 빨리 나타내주고 유모세포 하나하나의 손상정도를 더 잘나타내 줄 수 있다는 것을 뜻한다고 생각된다. 이 예방효과의 기전은 명백히 밝혀져 있지 않으나 특정조직의 이독성반응 부위에 fosfomycin이 cisplatin과 경쟁적으로 반응하여 발생하는 효과이거나, 세포막의 반응부위에 붙지 못하는 복합체를 형성하거나, 라이소좀의 기능에 영향을 주어 이독성 물질이 내이에 축적되지 못하게하여 작용한다고 생각하였다. 하지만 최근 cisplatin의 이독성의 기전으로 McAlpine과 Johnstone16)에 의하면 외유모세포의 calcium transduction channel의 억제에 의해 난청이 발생한다고 하였으며, Barron과 Daigneault에 의하면 cisplatin 투여후 와우의 Na-K-ATPase활성도가 없어짐을 보고하였다. Ravi 등17)은 superoxide dismutase와 diethyldithiocarbamate 같은 free radical scavenger 등을 이용한 antioxidant system을 사용하여 cisplatin의 신독성과 이독성을 감소시킬 수 있음을 보고하였다. 이와같이 cisplatin의 이독성 기전과 예방물질이 다양함을 보아 cisplatin의 이독성은 여러기전에 의한 복합적인 현상에 의해 발생하며 이 기전들 중 일부를 fosfomy-cin이 억제하여 발생하는 결과로 생각되며 기저부가 가장 예방적 효과가 큰 이유는 기저부가 fosfomycin의 축적이 가장 많이 되는 것이 아닌가 추측되어진다. 따라서 fosfomycin은 항암 환자에게 cisplatin을 투여시 이독성을 예방하기 위해 병용 투여 할 수 있는 약제로 생각되며 그 예방적 효과에 대한 기전 연구가 필요할 것으로 생각된다. 결론 기니픽을 실험 동물로 하여 8 mg/kg의 용량의 cisplatin을 복강내 주사한 군을 대조군으로 하여 cisplatin 8 mg/kg를 일회 복강주사한 후 fosfomycin 320 mg/kg을 7일간 투여한 군에서의 cisplatin 이독성을 주사전자현미경을 통한 기니픽 와우의 형태학적 변화와 전기생리학적검사를 관찰하여 fosfomycin을 병용투여한 군에서 cisplatin의 이독성이 감소되었다.
REFERENCES
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