|
|
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(11): 1643-1651. |
| Effect of PDGF-AA on the Healing Process of Tympanic Membrane Perforation and Expression of PDGF-Receptor and Fibronectin. |
| Soo Whan Kim, Yong Su Park, Ki Hong Chang, Sang Won Yeo, Seung Ho Cho |
| Department of Otolaryngology, The Catholic University of Korea, College of Medicine, Seoul, Korea. |
| 고막천공의 치유과정에서 PDGF-AA의 역할과 PDGF-수용체 및 Fibronectin의 발현 |
| 김수환 · 박용수 · 장기홍 · 여상원 · 조승호 |
| 가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
|
|
|
|
|
| ABSTRACT |
BACKGROUND:
In recent years, repair of tympanic membrane(TM) perforation has been investigated using growth promoting factors. Platelet derived growth factor(PDGF), basic 30kD cytokine, promotes wound healing by its mitogenicity for fibroblast and stimulation of the production of fibronectin and hyaluronic acid.
OBJECTIVES:
The purpose of this study is to investigate the effect of PDGF-AA on the healing process of TM perforation.
MATERIALS AND METHODS:
The effects of PDGF on the healing process of TM perforation was investigated in rats using the endoscope and light microscope after topical application of 2ug of PDGF-AA or placebo on the edge of TM perforation. The rats were sacrificed at 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 15 days following the surgery of TM. The tympanic membranes were also immunohistochemically examined for PDGF-Ralpha and fibronectin to evaluate the mechanism of healing process in the PDGF-treated-TM.
RESULTS:
1) Application of PDGF-AA accelerated the healing process of TM perforation and the wound was completely closed at 5 days following surgery. 2) PDGF-AA induced prominent proliferation of the connective tissue layer of TM after surgery, however the connective tissue growth has reduced at 2 weeks following surgery. 3) PDGF-Ralpha was intensely expressed in the epithelial layer of the PDGF-AA-treated TM. 4) Intense expression of fibronectin was observed in the fibroblasts of the connective tissue layer of the PDGF-AA-treated TM.
CONCLUSION:
From this study, we concluded that PDGF may play a role in the imm-unoregulation of the healing process of TM perforation and it may be an alternative to the surgical management of TM perforation. |
| Keywords:
PDGF-AAㆍTympanic membrane perforationㆍPDGF-RalphaㆍFibronectin |
서론
고막천공은 임상에서 흔히 보는 질환으로서 천공된 고막의 치유를 빠르게 하면서 고막의 기능을 정상적으로 회복시킬 수 있는 방법에 대한 연구가 계속적으로 진행되어 왔다. 최근 상피성장인자(epidermal growth factor, EGF)1-4), 섬유모세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF)5-7), 하이알루론산염(hyaluronic acid) 등의 일부 성장인자들에 관한 연구가 진행되어 왔으나 중이진주종의 형성, 치유된 고막의 위축성 변화 등의 후유증이 발생하여 임상적 적용이 어려운 상태이다.
고막의 긴장부는 외측 상피층, 중간 결합조직층, 내측 점막층의 3층으로 구성되며 다시 중간층은 내층과 외층으로 나뉘어지고 그 주위는 섬유모세포, 혈관, 신경에 의해 둘러싸여 있다. 고막의 재생은 상피의 증식과 이동, 섬유모세포의 증식, 염증, 섬유의 합성과 반흔의 재형성으로 이루어지는 복잡한 생물학적 작용의 결과이며 고막의 치유에 관여하는 분자학적 기전은 잘 알려져 있지 않다.6)
Johnson 등1)은 고막천공의 치유과정중 상피의 이동이 가장 중요한 역할을 하고 있음을 시사하였고, Alice 등3)은 상피성장인자를 이용하여 만성 고막천공의 치유를 시도하였으나 그중 일부에서 중이강내 진주종이 발생하였다.
PDGF(platelet derived growth factor)는 A, B 2개의 polypeptide chain이 disulfied bond에 의해 연결되어 이합체(AA, AB, BB)의 형태로 존재하는 성장인자로 분자량은 300,000 daltons정도이며 각 chain은 서로의 아미노기 배열상 60% 동질성을 공유하고 있다. 사람의 혈소판에는 PDGF가 3가지의 이합체의 형태로 모두 존재하고 순환 혈소판의 alpha granule에 저장되어 있다가 응고시 처음으로 분비되며 그 외에 대식세포, 혈관성 내피세포, 섬유모세포, 상피세포, 혈관 평활근세포등에서도 PDGF를 분비한다. PDGF수용체는 alpha, beta PDGF수용체의 형태로 존재하며 PD-GF-α수용체는 PDGF의 양쪽 chain 모두에 작용하며 PDGF-β수용체는 B chain에만 작용하여 유사한 생화학적 작용을 나타낸다.8-10)
Platelet derived growth factor(PDGF)는 결합조직세포에 대한 강력한 분열유발인자로서 섬유모세포와 평활근세포 등의 간엽세포(mesenchymal cell)의 분열을 촉진시키고 섬유모세포를 자극하여 콜라게나제(collagenase)를 생산 결합조직의 형성에 관여하며 아울러 glycosaminoglycans과 proteoglycans같은 결합조직 구성요소의 합성을 촉진시키고, 파이브로넥틴(fibronectin)과 하이알루론산염(hyarulonic acid)의 생산을 촉진하고, 섬유모세포에 의한 교원질 생산을 유발시키는 전환 성장인자(transforming growth fact-or-β, TGF-β)를 자극함으로써 상처치유를 촉진시킨다.8-10) 그 밖에도 정상 성인의 신장에 분포하면서 신장 손상시 재생역할을 하는 것으로 알려져 있다.9)
본 연구는 인위적으로 고막천공을 일으킨 흰쥐에 PD-GF-AA를 투여한 후 기간별로 수술현미경하에서 고막을 관찰하였고 광학현미경을 통해 고막의 치유과정을 병리조직학적으로 확인하였으며 또한 PDGF-AA에 의한 고막치유기전을 규명하기 위해 PDGF-α수용체(platelet derived growth factor-receptorα, PDGF-Rα)와 파이브로넥틴(fibronectin)에 대한 면역조직학적 검사를 시행하였다.
재료 및 방법
1. 실험 동물
외이 및 중이에 염증이 없는 체중 250g 내외의 건강한 흰쥐 14마리(28귀)를 사용하였다.
2. 마취 및 고막천공
마취를 위해 케타민(ketamine) 2mg/kg을 근육주사 하였다.
흰쥐의 외이도에 이경을 삽입하고 수술 현미경하에서 고막 긴장부 후방에 20gauge 주사침으로 직경이 약 1.5mm 크기가 되도록 천공을 만들었다. 모든조작은 무균상태하에서 소독된 기구를 사용하였으며 감염을 예방하기 위해 에리드로마이신(Erythromycin, 20mg/kg), 엠피실린(Ampicilin, 150mg/kg)을 경구 투여하였다.
3. PDGF-AA의 투여
고막천공을 양측귀에 만든 후 천공된 고막을 통해 양측 중이강내에 gelfoam을 1x1x1mm의 크기로 넣은 후 우측귀는 대조군, 좌측귀는 실험군으로 하여 좌측귀에는 1% 암소혈청알부민 100ul에 혼합된 PDGF-AA(DAKO, Denmark) 2ug을 1cc주사기를 이용하여 천공변연에 국소적으로 1회 투여하고, 오른쪽귀에는 같은 방법으로 1% 암소 혈청알부민 100ul만을 투여하였다.
4. 조직표본 제작
PDGF-AA 투여후 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15일에 각각 2마리씩 천공된 고막을 수술 현미경 으로 관찰하고 내시경(2.7mm)으로 고막을 촬영한 후 4% paraformldehyde(pH 7.4)로 심장 관류 고정을 시행하고 측두골을 절취하였다. 4% paraformaldehyde로 24시간 후 고정한 후 절취된 측두골을 4% paraformaldehyde와 8% EDTA(ethylenediamine tetra-acetic acid)(pH 7.4)로 6주간 탈회시킨 후 파라핀에 포매하고 4um의 두께로 박절하여 슬라이드에 부착시켰으며 H & E 염색을 하고 광학현미경하에서 관찰하였다.
5. 면역 조직화학적 검사
조직표본 슬라이드를 xylene과 histoclear가 1：3으로 혼합된 용액속에 1분씩 4회 담그므로서 파라핀을 완전히 제거한 후 100% 알코올로 탈수시키고 표면장력을 낮추어 모세관운동을 개선하였다. 10mM 인산완충식염수(phosphate buffer saline, PBS)로 4차례 세척한 후 labelled streptavidin biotin kit(DAKO, Denmark)를 사용하여 흰쥐의 측두골에서 PDGF-Rα(Santa Cruz, CA, USA)와 파이브로넥틴(DAKO, Denmark)의 발현을 관찰하였다. 내인성 과산화효소(endogenous peroxidase)의 활동을 억제하기 위해 파라핀이 제거된 조직슬라이드를 0.3% 과산화수소수로 상온에서 30분간 반응시킨 후 1% 암소 혈청알부민을 포함하고 있는 10mM 인산완충식염수에 1：200으로 희석된 PDGF-Rα와 같은 용액에 1：500으로 희석된 파이브로넥틴에 대한 단클론성 일차항체를 4℃에서 24 시간동안 반응시켰다. 그후 2차항체인 biotinylated anti-mouse immunoglobulin(DAKO, Denmark)으로 상온에서 1시간동안 반응시킨 후 streptavidin/Horse radish peroxidase(HRP)(DAKO, Denmark)로 상온에서 5분간 반응시켰으며 0.03% 과산화수소수를 포함하고 있는 AEC chromogen(3% 3-amino-9-et-hylcarbazole in N,N-dimethyl formamide)용액(DA-KO, Denmark)으로 상온에서 약7분간 발색시켰다. Meyer’s hematoxyline으로 대조염색을 시행한 후 광학현미경하에서 관찰하였다.
결과
1. 고막 관찰소견
PDGF-AA 투여군에서 고막천공 5일부터 15일까지 염증이 생긴 2귀를 제외한 10귀 모두에서 5일이후 고막의 완전유합이 이루어진 반면 대조군은 15일의 1귀에서만 고막의 완전유합이 이루어졌다. 수술후 3일째에는 두 군간의 특별한 차이를 관찰할 수 없었으나 그 이후에는 두 군간에 뚜렷한 차이를 나타내었다. PDGFAA 투여군중 5, 7, 9, 11일째에서는 모든 귀에서 다소 고막이 비후되면서 불투명한 색깔을 보였으며 13일째 2귀는 모두 두께는 감소되었으나 색깔은 불투명하였고 15일째 2귀는 두께도 감소되면서 색깔도 반투명한 양상을 보여 정상고막과 거의 유사해지는 양상을 보였다(Fig. 1, 2).
2. 광학현미경 소견
3일째에는 두 군간의 특별한 차이를 관찰할 수 없었다. PDGF-AA 투여군중 5, 7, 9, 11일째에는 외측 상피층은 대조군에 비해 약간 비후되어 있었고 중간 결합조직층은 현저하게 비후되면서 섬유모세포 및 신생혈관의 증식이 뚜렷하였으며 13, 15일째에는 두 층의 두께가 감소되면서 정상고막과 유사해지는 소견을 보였다. 한편 대조군은 13, 15일째에서 경도의 중간 결합조직층의 비후와 섬유모세포의 증식이 관찰되었으나 뚜렷하지는 않았다(Fig. 3, 4).
3. 면역조직화학적 검사
3일째에는 두 군 모두에서 PDGF-Rα와 파이브로넥틴이 발현되지 않았으나 PDGF-AA 투여군중 5, 7, 9, 11일에는 중간결합조직층의 섬유모세포에서 파이브로넥 틴이 뚜렷히 발현되었고 13, 15일째에 다소 감소되었으며 대조군에서는 11일째까지는 발현되지 않다가 13, 15일째에 다소 약하게 발현되었다. 한편 PDGF-Rα는 PDGF-AA 투여군중 5, 7, 13, 15일째에 외측 상피층의 상피세포에서 뚜렷히 발현된 반면 9, 11일째에는 발현되지 않았고 대조군에서는 7, 13일째에 각 1마리에서 약하게 발현되었다(Fig. 5, 6, 7).
고찰
이비인후과 영역에서 고막천공은 임상에서 흔히 경험하게 되며, 주로 외상, 급격한 압력의 변화, 급성 및 만성 중이염에 의하여 발생하는데, 외상 및 급성중이염에 의한 경우는 쉽게 천공이 치유되지만, 천공 크기가 크거나, 변연천공인 경우 또는 지속적인 감염의 경우와 같이 천공상태를 계속하여 유지하는 경우도 있다.11) 보존적 방법이나, 수술적 방법으로 천공의 치유를 도모함에 있어 창상 치유과정에서 고막두께의 변화, 고막경화의 발생, 청력감소, 진주종의 형성등 바람직하지 못한 합병증이 생길 수 있다.12) 따라서 고막천공의 치유속도를 빠르게 하면서 고막의 기능을 정상적으로 회복시킬 수 있는 방법에 대한 연구가 최근에 활발히 진행되고 있다. 고막천공 치유에 대한 연구는 2가지 방향으로 진행되어 왔는데 paper patch, 고실성형술, hyaluronic acid의 사용 등을 이용하여 새로 재생되는 조직을 지지하는 방법에 관한 연구13)14)와 세포의 재생과 이동을 촉진시키는 방법에 관한 연구15) 등으로 본 연구는 후자에 속한다.
고막의 치유과정에 대해서는 사람과 유사한 구조를 가지고 있는 기니픽, 흰쥐, 고양이 등을 이용한 많은 실험적 보고가 있으며, 임상적으로도 많은 연구가 시행되었다. Stenfors 등16)에 의하면 고막 천공의 치유과정은 천공 후 2일경에 천공연의 비후와 변연에서 삼출된 임파, 혈액, 조직액이 하부조직의 건조를 방해하고, 창상치유에 관계하는 상피세포의 이동을 용이하게 하는 매질로서 기능을 수행하며, 4∼5일경에는 변연부 모세혈관이 증식하여 창상의 변연부는 얇고 불규칙한 케라틴이 나타나기 시작한다고 하였다. 그리고, 천공 후 7일경에 결손부가 좁아져 케라틴의 연결과 상피의 연결이 생기며, 창상의 폐쇄후 새로이 형성된 반흔조직은 성숙이 진행되면서 두께가 얇아지게 되고, 이때 형성된 반흔조직은 성숙이 진행되면서 두께가 얇아지게 되고, 이때 형성된 반흔조직으로 인해 고막은 이소골과의 연결이 소실되어 중앙이 함몰된 정상적인 원추형의 모양을 잃고 평평하게 된다고 하였다.
일반적인 고막천공의 치유과정은 먼저 외측 상피층이 자라들어가 천공변연을 메우고 그 다음과정으로 중간 결합조직층이 외층을 지지대로 하여 자라면서 마지막으로 내층이 형성되어 유합이 이루어지는 것으로 알려져 있으며16) 본 연구에서도 동일한 과정으로 고막천공이 유합됨을 관찰할 수 있었다.
최근들어 고막천공의 치유과정에서 각종 성장인자의 영향에 대한 연구가 진행되었다. Mondain 등17)은 고막천공후 섬유모세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF) 1회 사용으로 6.1일에서 8.8일사이에 고막유합이 이루어 졌고 고농도로 사용할 때 고막에 염증이 생겼으며, 고막유합후 8일에 고막 조직소견상 대조군과 거의 차이점이 없었다고 보고하였다. O’Daniel 등18)은 고양이의 급성 고막천공을 이용한 실험에서 상피성장인자(epidermal growth factor, EGF) 1회 투여로 대조군에 비해 빠른 속도로 고막천공이 유합되었다고 하였으며, Amoiles 등3)은 만성 고막천공을 이용한 실험에서 상피성장인자를 투여한 고막이 대조군에 비해 3배이상 빠르게 유합되었고 12주후 조직학적으로 중간 결합조직층이 정상고막과 유사하게 변화하는 것을 관찰하였다. 본 연구에서는 PDGF-AA투여군에서 고막천공 5일 이후 모두 완전유합이 이루어진 반면 대조군에서는 2주 이후에도 유합이 이루어지지 않았다. 한편 PDGF-AA투여군에서 초기에는 대조군에 비해 외측 상피층과 중간 결합조직층의 비후가 현저하였으며 특히 중간 결합조직층에서의 섬유모세포의 증식이 뚜렷하였으나 15일군에서는 중간 결합조직층의 증식이 감소되어 정상고막과 유사한 양상을 보였다. 이는 PDGF-AA가 섬유모세포의 증식과 교원질의 합성을 통해 천공된 고막의 치유를 촉진시킬 수 있음을 시사한다.
파이브로넥틴은 외세포기질에 존재하는 거대 이합체성 단백질로 serum내에도 존재하며 3가지의 형태로 각각 존재하여 헤파린(heparin), 섬유소(fibrin), 콜라겐(collagen)같은 외세포 구조와 결합할 수 있다. 파이브로넥틴은 또한 외세포기질에 편재하는 구성요소로 피부의 창상치유시 중요한 역할을 한다. 피부 창상치유의 초기에는 외세포기질이 주로 파이브로넥틴으로 구성되며 나중에는 이기질이 콜라겐이나 proteoglycan으로 대치된다.19)20) 본 연구에서는 PDGF-수용체와 파이브로넥틴에 관한 단클론성항체를 이용하여 PDGF-AA로 유발된 고막천공의 치유과정에서 PDGF-수용체 및 파이브로넥틴의 역할을 관찰하였으며 면역조직화학적 검사상 PDGF-AA를 투여한 고막의 외측 상피층의 상피세포에서 대조군에 비해 PDGF-수용체의 발현이 뚜렷하였으며 중간 결합조직층의 섬유모세포에서는 파이브로넥틴의 발현이 현저하였다. 즉 고막이 천공되면 천공된 고막의 상피세포층에서 PDGF-수용체의 활동력이 현저히 자극되며 활성화된 PDGF-수용체에 PD-GF-AA가 결합함으로써 2차적으로 결합조직층내의 섬유모세포에서 파이브로넥틴의 생산을 촉진하게 된다. 분비된 파이브로넥틴은 외세포기질 유착분자로서 결합조직간의 유착을 유발시키고 콜라겐의 형성을 증가시킴으로써 천공된 고막의 유합을 촉진시키는 것으로 생각된다. 본 연구결과는 향후 임상에서 천공된 고막의 치유를 촉진하고 고막의 기능을 향상시키기 위해 수술적 치료법 대신 PDGF-AA의 임상적 사용가능성을 시사하고 있으나 PDGF-AA의 투여에 따른 부작용과 장기간의 관찰결과에 대한 연구가 필요할것으로 생각된다.
요약
고막천공의 조속한 치유와 정상적인 기능회복을 연구하기 위해 흰쥐 14마리(28귀)의 고막을 인위적으로 천공시킨 후 강력한 분열유발인자인 platelet derived growth factor-AA(PDGF-AA)를 투여하였으며 수술후 기간별로 내시경으로 고막을 관찰하고 광학현미경으로 병리조직학적 검사를 실시 하였으며 PDGF-α수용체와 파이브로넥틴에 대한 면역조직학적 검사를 실시하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
1) PDGF-AA투여 5일후 고막천공의 완전유합이 이루어 졌다.
2) PDGF-AA를 투여한 고막의 상피하층에서 섬유모세포의 증식이 뚜렷하였다.
3) PDGF-AA투여군중 5, 7, 9, 11일째 고막의 상피하층의 섬유모세포에서 파이브로넥틴 의 발현이 뚜렷하였다.
4) PDGF-AA투여군중 5, 7, 13, 15일째 고막의 상피세포층의 상피세포에서 PDGF-α 수용체가 뚜렷히 발현되었다.
이상의 결과는 PDGF-AA가 고막의 상피세포층의 세포에 있는 PDGF-α수용체에 결합 하여 2차적으로 섬유모세포에 의한 파이브로넥틴의 분비를 증가시킴으로서 고막천공의 치유를 촉진시킬 수 있음을 시사하고 있다.
REFERENCES
1) Lee AJ, Jackler RK, Kato BM, Scott N：Repair of chronic tympanic membrane perforation using epidermal growth factor：Progress toward clinical application. Am J Otol. 1994；15：10-18
2) Ramsay HA, Heikkonen EJ, Laurila PK：Effect of epidermal growth factor on tympanic membranes with chronic perforations：A clinical trial. Otolaryngol Head Neck Surg. 1995；113(4)：375-379
3) Amoils CP, Jackler RK, Lustig LR：Repair of chronic tympanic membrane erforations using epidermal growth factor. Otolaryngol Head Neck Surg. 1992 ；107：669-683
4) Dvorak DW, Abbas G, Welling DB：Repair of chronic tympanic membrane perforations with long-term epidermal growth factor. Laryngoscope. 1995；105：1300-1304
5) Fina M, Baird A, Ryan A：Direct application of basic fibroblast growth factor improves tympanic membrane perforation healing. Laryngoscope. 1993；103 ：804-809
6) Mondain M, Allen R：Epidermal growth factor and fibroblast growth factor are induced in guinea-pig tympanic membrane following traumatic perforation. Acta Otolaryngol (Stockh). 1995；115：50-54
7) Vrabec JT, Schwaber MK, Davidson JM：Evaluation of basic fibroblast growth factor in tympanic membrane repair. Laryngoscope. 1994；104：1059-1064
8) Cho MI, Lin WL, Genco RJ：Platelet-derived growth factor-modulated guided tissue regenerative therapy. J Periodontol. 1995；66(6)：522-530
9) Abboud HE：Role of platelet-derived growth factor in renal injury. Annu Rev Physiol. 1995；57：297-309
10) Hom DB：Growth factors in wound healing. Otolaryngol Clin North Am. 1995；28(5)：933-953
11) Spandow O, Hellstrom S：Animal model for persistent tympanic membrane erforations. Ann Otol Rhinol Laryngol. 1993；102：467-472
12) Truy E, Disant F, Morgan A：Chronic tympanic membrane perforation：An animal model. Am J Otol. 1995；16(2)：222-225
13) Hellstrom S, Laurent C：Hyaluronan and healing of tympanic membrane perforations：An experimental study. Acta Otolaryngol (Stockh). 1987；442：54-61
14) Spandow O, Hellstrom S, Dahlstrom M：Comparison of the repair of permanent tympanic membrane perforations by hydrocolloidal dressing and paper patch. Laryngol and Otol. 1995；109：1041-1047
15) Hom DB：Growth factors and wound healing in otolaryngology. Otolaryngol Head Neck Surg. 1994；110(6)：560-564
16) Kristensen S：Spontaneous healing of traumatic tympanic membrane perforations in man：A century of experience. 1992；106：1037-1050
17) Mondain M, Saffiedine S, Uziel A：Fibroblast growth factor improves the healing of experimental tympanic membrane perforation. Acta Otolaryngol (Stockh). 1991；111：337-341
18) O’Daniel TG, Petitjean M, Jones SC：Epidermal growth factor binding and action on tympanic membranes. Ann Otol Rhinol Laryngol. 1990；99：80-84
19) Schilling V, Holly A, Kastenbauer E：High levels of fibronectin in the stroma of aural cholesteatoma. Am J Otolaryngol. 1995；16：232-235
20) Mayot D, Bene MC, Faure GC：Immunohistologic analysis of the cholesteatoma matrix in children. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 1991；22：115-124
|
|
|
|
PDF Links
Full text via DOI 
Download Citation 
