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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(2): 286-291. |
| Expression of Fos Protein in Brainstem Vestibular Nuclei of Rat - I. Off-axis Centripetal Acceleration -. |
| Han Kyu Suh, Ho Jeong Park, Hyun Ho Lim, Soon Jae Hwang |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. |
| 흰쥐 뇌간 전정핵에서 Fos 단백의 발현 - Ⅰ. 구심성 주변축 회전자극에 따른 발현 양상 - |
| 서한규 · 박호정 · 임현호 · 황순재 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| ABSTRACT |
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Fos, the protein product of c-fos gene, has been known to be rapidly expressed in neurons following various external and internal stimuli. This experiment was performed to determine whether off-axis centripetal acceleration cause a proper stimulation to the otolith organ and the afferent neural pathway from the otolith organ can be mapped by detection of expressed Fos protein. Therefore we performed on-axis and off-axis centripetal acceleration stimulation to experimental animals and investigated Fos expression immunohistochemically. In results, there were no expression of Fos protein following on-axis centripetal acceleration, whereas in the medial, descending vestibular nuclei and y-group of the off-axially stimulated animal, we could find strong expression of Fos protein. |
| Keywords:
Off-axis centripetal accelerationㆍFos proteinㆍVestibular nuclei |
서론
말초 신경계의 자극 후 중추신경계로 전달되는 신경전도로는 매우 복잡하나 정상 신경전달 경로를 알면 병적 상태에서 비정상적으로 반응하는 중추신경계의 부위를 알 수 있는 자료가 되므로 신경전도로를 정확히 mapping 하려는 연구가 많이 이루어지고 있다. 현재까지는 단일신경 자극법 같은 전기생리학적 방법이나 방사선 동위물질을 표지한 deoxy-glucose나 HRP(horseradish peroxidase) 같은 추적물을 이용하는 방법들이 사용되어 왔으나 이런 방법들은 고가의 장비와 세밀한 기술을 요하는 어려움이 있어 근래에는 해부학적 표지자를 이용하여 쉽고 정확하게 신경전달로를 관찰하려는 연구가 많이 이루어지고 있다.19)22)
여러 신경활성 표지자 중 전구종양유전자의 일종인 c-fos의 단백산물인 Fos 단백이 외부나 내부 자극 후 시납스를 경유한 자극에 의하여 신경세포의 핵에서 발현한다는 사실이 알려지면서 중추신경계의 신경전달체계를 연구하는 신경활성을 나타내는 표지자로 많이 이용되고 있으며5-7)11)16)17)21)23)26) 또한 동시에 여러 발현 장소를 관찰할 수 있어 반사경로 연구에 적절한 표지자로 이용되고 있다.13)18)
저자들은 말초 전정기관 중 이석기관을 자극하기 위하여 실험동물에 off-axis centripetal acceleration을 주고 뇌간의 전정신경핵에서 Fos 단백이 발현되는 부위를 관찰하여 현재까지 알려진 이석기관의 중추투사 경로와 비교하여 off-axis centripetal acceleration이 이석기관의 자극방법으로 타당하며 Fos 단백이 전정신경계의 신경전달로 연구에 이용할 신경활성 표지자로 유용한가를 알아보기 위하여 본 연구를 시행하였다.
실험방법
실험 동물은 체중 150에서 200gram 사이의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 사용하였다. 체중 100gm 당 0.5ml의 우레탄을 복강 내에 주사하여 경미하게 마취시킨 후 회전자극을 주었다. 회전자극은 모터의 축상(on-axis)과 회전축에서 25cm 떨어진(off-axis) 위치에 실험동물을 고정시키고 회전 자극을 시계방향으로 90분간 분당 60, 90, 120회의 속도로 주었다. 회전 방향의 반대편인 좌측 전정기관의 영향을 없애기 위하여 수술현미경하에서 등골을 제거하여 난원창을 확인한 후 끝이 뾰쪽한 후크와 흡입기를 이용하여 전정내의 말초 전정 수용기를 제거하고 전정 독성 물질인 sodium arsanilic acid(Sigma사, 미국)를 적신 젤폼을 전정 내에 넣어 화학적 미로절제술을 추가로 시행한 후 2일 뒤에 회전자극을 주고 희생시켰다.
회전 자극을 위한 회전기는 회전판과, 회전판을 돌리는 모터, 회전수를 조정하는 계측기(tachometer), 그리고 회전수를 감지하는 감지기로 구성되어 있고 실험동물은 양쪽 외이도와 턱, 두정부를 고정시킨 후 회전자극을 주었다.
모터의 축상에서 회전시키는 on-axis rotation시 실험동물은 중력방향으로 구심력을 받지 않으나 축에서부터 떨어진 위치에서 회전시키는 off-axis rotation 때는 축으로부터의 거리와 회전속도의 제곱에 비례하여 다음과 같은 구심력을 받게 된다.2-4)12)14)
구심력(g)＝Rw 2(R：반지름, w：회전각속도)
본 실험에서는 축으로부터 25cm 떨어진 곳에서 구심성 회전자극을 시켰으므로 구심력을 계산하면 60 RPM의 회전자극을 준 경우에는 1G, 90RPM에서는 2G, 120 RPM에서는 4G의 구심력이 실험동물에 부하 되었다.
모든 실험은 빛이 완전히 차단된 곳에서 시행하였고 회전기의 소음은 60dB 이하였다.
실험동물은 90분간 회전자극을 주고 30분 후에 심관류하여 희생시키고 뇌조직을 얻어 뇌간의 전정신경핵이 관찰되는 부위를 냉동절편기를 이용하여 40μm 두께로 동결 절편을 만들었다.
절편들을 0.3% H2O2/PBS로 10분 동안 상온에서 처리하고, Phosphate Buffered Saline(PBS, pH 7.4)으로 10분씩 세차래 행군 후 2% Bovine Serum Albumin(BSA/PBS)에 한시간 동안 실온에서 처리한 다음 다시 PBS(pH 7.4)로 10분씩 세차래 행군 후 일차항체(poly-clonal anti-c-fos antibody, Cambridge사. 영국)를 1：2,000의 농도로 4℃에서 하룻밤동안 반응시켰다. 하룻밤동안 반응을 한 절편은 PBS로 10분씩 세차래 행군 후 이차항체(biotin-labeled anti-sheep IgG)로 실온에서 한시간 동안 반응 시켰다. 위와 동일한 방법으로 다시 PBS로 10분씩 세차래 행군 후 DAB(0.05% 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride/0.006% H2O2/0.05M PBS, pH 7.4)액에 약 5분 담구어 발색반응을 시킨 후 광학현미경하에서 면역조직화학적 염색 반응성을 관찰하였다. 위의 모든 과정은 floating시켜 실행하였다.
결과
1. On-axis centripetal acceleration후 Fos 단백의 발현
회전축선상에서 회전자극을 준 동물의 뇌간전정핵에서는 모든 회전자극에서 Fos 단백의 발현이 관찰되지 않았다.
2. Off-axis centripetal acceleration후 Fos 단백의 발현
회전축에서 25cm 떨어진 주변축에서 구심성 자극을 준 실험동물에서는 4G의 구심력을 부하 시킨 120 RPM의 회전자극에서 Fos 단백이 강하게 발현되는 것을 관찰할 수 있었다. 좌측 미로절제술을 시행한 경우 우측 내전정신경핵에서 Fos 단백의 발현이 관찰되었으나 좌측에서는 Fos의 발현이 없었고(Fig. 1) 발현된 Fos 단백은 둥글고 적갈색으로 진하게 염색되었으며(Fig. 2) 내전정신경핵 중 제 4 뇌실에 접한 상부에서 주로 발현되었다. 하전정신경핵에서는 적은 양의 Fos 단백의 발현이 관찰되었으나(Fig. 3) 거세포(giant cell)가 보이는 외전정신경핵이나 상전정신경핵에서는 Fos의 발현이 관찰되지 않았다.
난형낭의 감각신경 수용체에서 감지된 구심성 신경섬유의 상행분지가 대부분 종료하는 곳으로 알려진 y 핵에서 Fos 단백의 강한 발현이 관찰되었으나(Fig. 4) 모든 반규관의 팽대부에서 감지된 구심성 경로가 종료하는 간질핵(interstitial nucleus)에서는 Fos 단백의 발현이 관찰되지 않았다.
고안
외부자극에 의하여 경시납스 신호(trans-synaptic signal)가 발생하면 신경세포는 정보를 상위 중추신경계로 전달하기 위하여 칼슘 채널이 열리고 이차 전령(second messenger)이 생성되는 등의 변화가 수 초에서 수 분내에 신경세포 내에서 빠르게 일어나며 아울러 유전자 발현에 관여하는 완,급반응이 일어나 자극에 적절히 반응하기 위한 신경세포의 새로운 프로그램이 발생하게 된다.8)20)24)25) 신경반응의 초기에 발현되는 유전자 중 c-fos가 가장 조기에 발현되며17) 이 유전자에 의하여 생성된 Fos 단백을 이용하여 말초자극의 중추투사 경로를 이해하려는 연구가 많이 시행되고 있다. 특히 전기자극 후에 실험동물의 뇌조직에서 c-fos가 발현되었다는 Morgan등19)의 보고이래 Fos 단백의 발현양상은 중추신경계의 기능적 흥분경로를 연구하는 표지자로 많이 이용되고 있다.
c-fos는 자극이 없는 상태에서는 발현되지 않으나 외인성 자극에 의하여 쉽게 유발된다. 실험동물에 전기자극을 주거나15)22), 간질 유발제의 투여9)19), 음자극16)23), 온도자극5), 화학자극7) 같이 외부자극을 가한 후에 c-fos 의 발현이 증가된다. 또한 신경전달물질이나 신경성장인자의 투여나21) 생후 뇌의 발달단계에 따라 Fos 단백의 발현 양상이 다르다는 Kaufman등13)의 보고로 보아 내인성 자극 후에도 발현이 증가된다. 그러나 계속되는 반복자극이 있을 경우는 오히려 c-fos 유전자의 발현이 감소된다는 Winston등26)의 보고로 보아 Fos 단백이 c-fos 유전자의 발현을 하향조정(down-regulation)하는 귀환회로(feedback)의 역할을 행하는 것으로 생각된다. 상기한 여러 실험 결과를 유추해 보면 감수분열후 신경세포(postmiotic neuron)에서도 시납스를 통한 자극이 있을 경우 c-fos 가 발현된다는 것은 c-fos 가 신경세포의 발달이나 가소성(plasticity)에 관여하리라고 생각된다.
Fos 단백의 발현을 이용한 신경전달로의 연구는 필요한 감각기만 자극시킬 수 있다면 매우 간편하고 용이한 방법이나 현재 생물 대사학적 표지자로 사용하기에는 몇 가지 문제점을 가지고 있다. 우선 c-fos 가 완전하고 특이성이 높은 표지자가 아니기 때문에 실험과정 중에 올 수 있는 다른 자극에 의하여서도 쉽게 발현되기 때문에 교차반응이 많다는 점이다.6) 본 실험에서도 전정핵 기능의 억제를 최소화하기 위하여 마취를 가볍게 했으나 이 경우 실험동물의 고정부위에서 오는 통증이나 운동억제에 의한 스트레스 등에 의하여 c-fos 가 발현될 수 있다. 이렇게 원치 않는 교차반응을 줄이기 위하여서는 가능하면 일차 항체의 희석 비율을 높게 하여 사용하여야 한다. 본 실험에서는 다른 저자들 보다 낮은 희석배율에서 일차항체를 사용하였다. 실험 결과 높은 희석농도에서는 교차반응에 의한 비특이적인 결과는 줄어들었으나 c-fos 의 발현이 실제 발현되는 양보다 과소평가 되어, 희석비를 낮게 하고 비특이 반응을 줄이기 위하여 과산화 수소와 정상 혈청과의 반응을 오래 시킨 결과 배경의 교차반응 없이 c-fos 의 발현을 잘 관찰할 수 있었다. 또한 뇌간의 전정핵 부위만 관찰대상으로 보았기 때문에 통증이나 기타 이석기관의 자극 이외의 자극에 의한 c-fos 의 발현은 결과 해석시 제외할 수 있었다. 그러나 본 실험에서 관찰된 Fos 단백의 발현이 기존에 알려진 이석기관의 신경전달로와 일치하는 결과를 얻었지만 Fos 단백이 발현된 전정신경의 수가 Gacek10)과 이, 박1)이 발표한 추적물를 이용한 결과에 비하여 매우 적은 세포에서만 관찰되었다. 이 사실은 정확한 이유는 알 수 없지만 c-fos 를 발현시키기 위하여 자극시간을 장시간 주었기 때문에 전정신경의 가소성에 의하여 적은 수의 신경만 반응한 것인지 아니면 특정 신경세포가 오히려 자극 역치가 낮아 쉽게 c-fos가 발현된 것인지 명확한 이유는 알 수 없다. 또한 특별한 신경전달물질을 가진 신경세포나 특정 신경전달물의 수용체를 지닌 신경세포에서만 c-fos가 발현되기 때문에 자극 받은 전체 신경핵 중 일부에서만 Fos 단백이 발현된 것으로 생각되며 이에 대한 연구와 규명이 Fos 단백을 신경전달경로 연구의 표지자로 사용하기 위하여 선행되어야 할 향후 과제라 생각된다.
결론
실험동물에 off-axis centripetal acceleration을 주어 4G의 구심력을 받게 한 후 뇌간의 전정핵에서 Fos 단백의 발현을 관찰한 결과 off-axis centripetal acceleration은 이석기관에 선택적으로 자극을 줄 수 있는 적절한 방법이라 생각되며 c-fos의 단백산물인 Fos 단백은 전정기관의 구심성 신경전달경로상의 신경세포의 활성정도를 선별 연구할 수 있는 신경활성의 표지자로 유용한 도구라 생각되며 감수성이나 특이성을 높이기 위하여서는 c-fos의 mRNA에 대한 정량분석이 필요하다고 생각된다.
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