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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(1): 28-33. |
| The Significance of DNA Image Analysis in Laryngeal Keratosis. |
| Jong Ouck Choi, Jae Yong Lee, Kyung Hyun Kim, Kwang Yoon Jung, Geun Choi |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Korea University, College of Medicine, Seoul, Korea. |
| 성대 각화증에서 화상분석기를 이용한 핵산분석의 의의 |
| 최종욱 · 이재용 · 김경현 · 정광윤 · 최 건 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| ABSTRACT |
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Early diagnosis of laryngeal keratosis, a precancerous lesion, is important since it has the possibility to make a malignant change. Since it is believed that laryngeal keratosis progresses to carcinoma in situ or invasive carcinoma through the stage of epithelial proliferation and epithelial dysplasia, if we can predict this progression it will aid in the early diagnosis and treatment of laryngeal cancer. The authors used image analyzer to obtain the DNA index and proliferation index after DNA staining of keratotic epithelial cells to determine the probability of malignant change in laryngeal keratosis. We used specimen obtained from 38 cases of laryngeal keratosis. DNA ploidy was determined by obtaining DNA index with image analyzer(CAS 200, Image analyzer, CAS Ins, USA). And, proliferation index was obtained by ratio of cell content in S phase to G2/M phase of cell cycle. DNA ploidy in mild and moderate dysplasia showed diploidy in all cases, however, in four of nine cases of severe dysplasia showed aneuploidy.
Cellular proliferation index in mild dysplasia was 7.5+/-3.12, in moderate dysplasia was 12.3+/-5.71, and in severe dysplasia was 15.8+/-4.21, and statistically significant(p<0.05) high cellular proliferation index was observed in relation to pathological classification.
Therefore, DNA analysis using image analyzer can be used to determine the degree of progression of laryngeal keratosis, and it is thought as an objective method for predicting the probability of malignant change and prognosis of the patient. |
| Keywords:
Laryngeal keratosisㆍImage analyzerㆍDNA ploidyㆍProliferation index |
서론
전암성 병변인 후두각화증은 조직병리학적으로 성대의 상피비후가 주 병변인 질환으로 단순한 상피의 증식만을 보이는 단순 상피증식증과 상피의 이형을 동반한 상피이형성증으로 대별된다.2)5)12)14)16)
후두각화증의 악성화율은 조직병리학적 이형성 정도와 밀접한 관계가 있다.12) 따라서 후두각화증이 단순한 상피증식을 보인 후 상피의 이형성을 거쳐 상피내암이나 침윤성 암종으로 이행하는 것으로 추정되어 이러한 과정을 미리 예측할 수 있다면 후두암종의 조기진단 및 치료에 많은 기여를 할 것으로 생각된다.
성대 각화증의 진행정도를 반영하는 상피이형성 정도는 채취된 조직이 소량으로 인하여 객관적으로 이형정도를 파악하기에 논란의 여지가 있다.3) 이에 저자들은 각화상피세포의 핵산염색을 시행한 후 화상분석기를 이용하여 핵산지수 및 증식지수를 산출함으로써 후두각화증이 암종으로 이행할 가능성을 파악하여 후두암종의 조기진단 및 치료에 도움을 얻고자 연구를 시행하였다.
대상 및 방법
1. 대상
대상은 1991년 1월부터 1995년 12월까지 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실에서 문진 및 이학적 검사상 후두각화증이 의심되어 자보현수후두경하에서 후두미세수술을 시행하였던 후두병변 55례중 조직병리학적으로 후두각화증으로 진단된 38례(경도 상피이형증 15례, 중등도 상피이형증 10례, 고도 상피이형증 9례, 상피내암종 4례)를 대상으로 비교분석하였다(Table 1). 대상의 남여 성별분포는 8.5：1, 평균연령은 54.2±8.23세이었다.
2. 방법
전신마취하에 자보현수후두경하에서 생검한 신선조직을 touch imprint법으로 도말하고 Feulgen-Schiff 방법에 의하여 핵산염색을 시행한 후 화상분석기를 이용하여 핵산지수 및 증식지수를 측정하였다. 동일한 조직을 10% 중성 포르말린에 고정한 후 제작한 통상적인 파라핀 포매조직을 5μm 절편으로 만들어 Hematoxylin-Eosin 염색을 시행하여 조직병리학적으로 평가하였고, 정상 대조군으로는 편도조직을 이용하였다.
1) 핵산염색방법
(1) 생검한 신선조직을 사용하여 보정용 정상세포(rat hepatic cell)가 도말되어 있는 깨끗한 슬라이드에 조직의 손상을 최소로 줄이면서 기저세포층의 세포가 되도록 많이 도말될 수 있도록 골고루 도말하였다.
(2) 실온에서 1시간 정도 건조 후 10% 중성 포르말린에 30분간 고정하고 증류수에 3회 수세 후 실온에서 완전히 건조시켰다.
(3) 준비된 검체는 5N HCl에서 60분간 가수분해 시킨후 유동판(stir plate) 위에서 Schiff 염색액과 반응시켰다.
(4) 세정액에 3회 세척 후 수세하고 1% 산성알콜에 반응시킨 다음 탈수, 봉입하였다.
2) 상피이형증 정도에 따른 핵산 배수성
Feulgen-Schiff 방법에 의하여 시행한 핵산염색에 대한 생화학적인 반응은 컴퓨터를 이용한 화상분석기 (CAS 200 Image analyzer, CAS ins., USA)로 정량하였다. 400배 현미경 하에서 상피세포를 200개 내지 300개를 선택하여 분석하였으며 핵산의 함량은 전산화되어 주도표(histogram)로 나타나게 되는데 핵산의 배수성은 정상 이배수성 세포의 핵산함량 평균값인 7.18pg을 기준으로 하여 검체의 G 0/1세포의 핵산 함량의 비를 핵산지수(DNA index, DI)로 하였으며 핵산지수가 0.90∼1.10이면 이배수성으로, 이배수성이 아닌 경우는 비배수성으로 구분하였다.
3) 상피이형증 정도에 따른 세포증식지수
화상분석기를 이용하여 분석한 주도표 하에서 G 0/1, S, G 2/M기를 각각 면적 A, B, C로 구분하여 이중 S기와 G2/M기의 세포백분율을 합하여 증식지수 값으로 정하였다(Fig. 1, 2).
4) 후두각화증의 조직병리학적 분류
후두각화증은 조직병리학적으로 Crissman의 분류에 의하여3) 과각화증과 극세포증이 있으며 이형성이 적은 경우를 경도 이형성증(mild dysplasia, grade I), 이형성이 일부 관찰되는 경우를 중등도 이형성증(moderate dysplasia, grade II), 미분화 세포의 증식 및 현저한 이형성과 유사분열이 관찰되는 경우를 고도 이형성증(severe dysplasia, grade III)으로 대별하였으며, 악성 암종에서 볼 수 있는 조직학적, 구조적 변형을 하였으나 기저막 하부에 침윤이 관찰되지 않는 경우를 상피내암종(carcinoma in situ)이라 정의하였다.
5) 통계학적 검증
통계학적 처리는 unpaired t-test와 분산분석(ANOVA)을 이용하여 평균치 간의 유의성을 검증하였고, 이때 유의수준은 95.0%로 하였다.
결과
1. 상피이형증 정도에 따른 핵산 배수성
핵산 배수성은 경도와 중등도 상피이형증 모두에서 이배수성이었으나, 고도 이형성증은 9례중 4례(44%)에서, 상피내암종은 4례중 2례(50%)에서 비배수성을 관찰할 수 있었다(Table 2).
2. 상피이형증 정도에 따른 세포증식지수
세포의 증식지수는 대조군에서 4.5±1.19인 반면, 경도 이형성증 7.5±3.12, 중등도 이형성증 12.3±5.71, 고도 이형성증이 15.8±4.21(Table 3)로 Crissman의 병리조직학적 구분에 따른 이형도에 비례하여 의미있게 증식지수가 높았다(p<0.05).
고찰
후두각화증은 암전구증이기 때문에 조기진단 및 치료시기를 간과할 경우 치명적인 결과를 초래할 수 있다. 후두각화증에서 후두암종으로의 이행은 보통 단순 각화증에서 이형성이 나타나는 시기를 거쳐 후두암종으로 진화되기 때문에 이러한 각화증의 조기진단과 이형성의 진행정도를 파악하는 것이 중요하다.2)3)12)14)
세포의 증식능은 인체 종양에서 신뢰할 만한 예후인자로 알려져 있으며, 핵산의 비배수성은 많은 고형성 종양에서 생존율과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다.10)13)19)20)21) 많은 연구자들1)6)15)17)에 의해 세포내 핵산측정이 이루어져 서로 다른 부위의 전암성 병변 및 악성종양에 대한 핵산검사를 통해 예후의 추정이 가능하게 되었는데, 유방암, 폐암, 대장암, 방광암, 난소암, 자궁경부암 등에서는 비배수성 세포를 갖는 경우에 예후가 나쁜 것으로 보고되고 있으며, 급성임파구성백혈병이나 신경아세포종, 윌름종양(Wilms’ tumor) 등에서는 비배수성 세포를 갖는 경우에 좋은 예후를 갖는 것으로 보고되고 있다.1)15) 비배수성은 고형성 암종에서의 특성중 하나이고 대개의 악성종양에서 핵산 이배수성의 종양이 비배수성의 종양보다 양호한 예후를 갖게 된다.1)6)17)
조직세포의 핵산검사를 위한 방법으로는 유세포분석기와 화상분석기가 많이 사용되는데 유세포분석기는 20,000 내지 30,000정도의 세포를 분석하여 높은 해상력을 지닌 histogram을 얻을 수 있고 세포주기중 S기에 해당되는 종양세포의 비율을 구할 수 있다는 장점이 있는 반면, 화상분석기는 150내지 200개 정도의 적은 수의 세포만을 측정하지만 병리학자나 병리기술자에 의해 선택된 세포만을 검사하므로 비종양세포나 괴사성세포 등을 제거할 수 있어 종양세포만을 검사할 수 있고 대부분의 경우에서 믿을 만한 S기 비율을 구할 수 있다는 장점이 있다.18) 본 연구에서는 유세포분석기를 대신하여 일부세포의 도말만으로 검사가 가능한 touch imprint법으로 처리하고 화상분석기를 사용하여 조직의 손상없이 세포의 핵산함량 및 증식지수를 측정할 수 있었다.
Crissman4)은 후두 편평세포암의 경우 침윤성암으로 전환되는 과정에서 상피세포내의 종양성 전환(neoplastic transformation)이 선행된다고 하였고, 핵산의 비배수성이 종양성 전환여부에 대한 지표가 될 수 있다고 하였으며, 세포증식지수가 상피이형정도에 따라 증가된다는 사실에 대해 언급한 바 있다. 저자들의 연구에서도 경도와 중등도 상피 이형증 모두에서 이배수성이었으나 고도 이형성증 9례중 4례에서, 상피내 암종은 4례중 2례에서 비배수성을 관찰할 수 있어 이형성증이 진행됨에 따라 비배수성이 증가함을 관찰할 수 있었고, 세포의 증식지수는 대조군에서 4.5인 반면, 경도 이형성증 7.5, 중등도 이형성증 12.3, 고도 이형성증이 15.8로 Crissman의 병리조직학적 구분에 따른 이형도에 비례하여 의미있게 증식지수가 높았음을 관찰할 수 있었다.
핵산배수성에 대한 임상적 적용에 관한 연구 결과에서 일부 종양을 제외한 대부분의 악성종양의 경우 같은 병변에서 이배수성인 예가 비배수성인 예보다 예후가 좋은 것으로 보고되고 있다.2)7)8)9)11) 핵산검색과 예후의 관계에 대한 연구는 초기병변이나 전암성 병연에서 특히 중요할 것으로 생각되는데 이러한 병변의 경우 치료방법의 선택폭이 넓고 완치될 가능성이 높기 때문이다.
저자들의 연구에서 보이는 바와 같이 화상분석기를 이용한 핵산분석은 성대 각화증의 진행정도를 파악하는 객관적인 지표의 하나로 이용될 수 있을 것으로 제시된다. 그러나 이보다 임상적으로 중요한 악성으로의 전환 가능성과의 관계를 알기 위하여는 계속적인 추적관찰과 연구가 필요할 것으로 생각되었다.
결론
화상분석기를 이용한 후두각화증의 핵산분석결과 상피세포의 이형도가 진행될수록 핵산의 비배수성이 증가하였으며 세포의 증식지수 역시 이형도에 비례하여 의미있게 증가하였다. 따라서, 화상분석기를 이용한 핵산분석은 후두각화증의 진행정도를 파악하는 객관적인 지표의 하나로 이용될 수 있으며, 악성으로의 전환가능성과 환자의 예후를 예측하는 보조적 지표가 될 수 있을 것으로 생각된다.
REFERENCES
1) 김광현·성명훈·정종우 등：유세포계측검색으로 측정한 후두암세포의 DNA 양상에 관한 연구. 한이인지 35(6)：783-793, 1992
2) 주형로·이선희·최종욱 등：후두 편평상피의 전암성 및 악성병변에서 화상분석기를 이용한 핵산 검사와 Ki-67항체 양성세포의 분석. 한이인지 26(3)：466-473, 1994
3) Crissman JD, Fu YS：Intraepithelial neoplasia of the larynx；A clinopathologic study of six cases with DNA analysis. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 112：522-528, 1986
4) Crissman JD：Laryngeal keratosis preceding laryngeal carcinoma. Arch Otolaryngol 108：445-448, 1982
5) Fechner RE：Laryngeal keratosis and atypia. Can J Otolaryngol 3：516-521, 1974
6) Frankfurt OS, Slocum HK, Rustum YM：Flow cytometric analysis of DNA aneupoidy in primary and metastatic human solid tumors. Cytometry 5：71-80, 1984
7) Franzin G, Klintenber C, Olofsson J：DNA measurementan objective predictor of response to irradiation? A review of 24 squamous cell carcinomas of the oral cavity. Br J Cancer 53：643-651, 1986
8) Frederikson P, Reske-Nielsen E, Bichel P：Flow cytometry in tumors of the brain. Acta Neuropathol 41：179-183, 1978
9) Ganslen T, Chatten J, Varello M：Flow cytometric DNA analysis of neuroblastoma；Correlation with histopathology and clinical outcome. Cancer 58：2453-2458, 1986
10) Geredes J, Lelle RJ, Pickartz H, et al：Growth fraction in breast cancers determined in situ with monoclonal antibody Ki-67. J Clin Pathol 39：977-980, 1986
11) Goldsmith MM, Cressin DH, Arnold LA, et al：DNA flow cytometry as a prognostic indicator in head and neck cancer. Otolaryngol Head Neck Surg 96：307-318, 1987
12) Henry RC：The transformation of laryngeal leukoplakia to cancer. J Otol 93：447-459, 1979
13) Kaplan AS, Caldarelli DD, Chacho MS, et al：Retrospective DNA analysis of head and neck squamous cell carcinoma. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 112：1159-1162, 1986
14) McGavran MH, Bauer WC, Ogura JH：Isolated laryngeal keratosis；Its relation to carcinoma of the larynx based on a clinicopathologic study of 87 consecutive cases with long-term follow up. Laryngoscope 70：932-936, 1960
15) Merkel DE, Dressler LG, McGuire WL：Flow cytomerty, cellular DNA content and prognosis in human malignancy. J Clin Oncol 5：1690-1703, 1987
16) Norris LH, Peale AP：Keratosis of the larynx. J Laryngol Otol 77：635-639, 1963
17) Raber MM：Clinical application of flow cytometry. Oncology 2(3)：35-39, 1988
18) Regina GE, Paul JD, Thomas LC, et al：DNA content of head and neck squamous carcinoma by flow and image cytometry. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 120：294-297, 1994
19) Shepherd NA, Richman PI, England J：Ki-67 derived proliferation activity in colorectal adenocarcinoma with prognostic correlations. J Pathol 155：213-219, 1988
20) Takafumi U, Katsuyuki A, Masahiko T, et al：Prognostic significance of Ki-67 reactivity in soft tissue sarcomas. Cancer 63：1607-1611, 1989
21) van Dierendonck JH, Keijzer R, van de Velde CJH, et al：Nuclear distribution of the Ki-67 antigen during the cell cycle；Comparison with growth fraction in human breast cancer cells. Cancer Res 49：2999-3006, 1989
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