교신저자：안진철, 330-714 충남 천안시 안서동 29-1  단국대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
교신저자：전화：(041) 550-1786 · 전송：(041) 556-1788 · E-mail：jcahn@dankook.ac.kr

서     론

   광역학치료(Photodynamic Therapy；PDT)는 체내의 풍부한 산소와 외부에서 공급되는 레이저와 레이저 빛에 예민한 반응을 보이는 광감작제를 이용한 새로운 암치료 방법이다. 현재 PDT는 접근이 비교적 용이한 식도, 폐, 후두 등의 고형 종양을 치료하는 데 있어 중요한 방법으로 자리매김을 하고 있다. PDT로 종양 파괴 효과를 얻는 기전은 광감작제가 정상 세포에 비해 암세포 내에 더 효과적으로 흡수가 되며 체내 투과를 잘 하는 빛의 파장에 반응하는 특성을 가지고 있어서 빛을 받는 경우에 특징적인 광독성을 나타내기 때문이다.¹⁾
   PDT는 다음과 같은 과정을 거쳐 효과를 내게 된다. 우선 광감작제를 암세포 혹은 목표로 하는 조직에서 흡수시킨다. 그 후 조직에 특정 파장을 조사하면 광감작제가 활성화된다. 조직 내에 존재하는 산소분자는 빛의 조사를 받은 후 활성화산소기(Reactive Oxygen Species；ROS)로 변화된다. ROS의 발생 기전은 두 가지 반응 방법으로 설명할 수 있다. 먼저 광감작제가 전자전달계에 관여하여 free radical이 형성되는 Type Ⅰ 반응이 있다. 또한 산소와 에너지 전이로 반응하여 활성화 산소기를 생성시키는 Type Ⅱ 반응이 있다. 이렇게 PDT를 통해 생성되는 ROS는 대표적으로 Hydroxyl radical, Singlet oxygen 등을 들수 있다.^2,3)
   본 연구에서 사용된 광감작제 9-Hydroxypheophorbide-a(9-HpbD-a)는 녹조류인 Spirulina platensis의 chloro-phyll-a로부터 금속이온을 제거한 피오파이틴-a와 여기의 phytol기를 가수분해시킨 Pheophorbide-a로부터 유도된다. 9-HpbD-a는 기존에 사용되던 광감작제인 hemato-phorphyrin derivative(HpD)가 갖는 단점을 보완할 수 있는 광감작제이다. 기존의 광감작제에 비해 빠르게 배설되기 때문에 체내의 누적을 방지할 수 있다. 또한 기존의 HpD 계열의 광감작제가 630 nm 영역의 흡수 파장에서 최대 활성을 보이는 반면 9-HpbD-a의 최대 흡수 파장은 660 nm로 가시광선 영역에서 흡수도가 높아 상대적으로 긴 파장의 레이저를 조사할 수 있다. 이렇게 긴 파장을 조사하면 빛이 조직에 더 깊이 침투되고 광역학치료의 효과가 더 높아지게 된다.⁸⁾
   본 연구에서는 인체 두경부 암세포(AMC-HN3)에서 9-HpbD-a를 이용한 PDT의 과정에 대해 연구하였다. PDT 시행 후 광감작제가 ROS를 발생시키는지 여부를 보고, 이때 9-HpbD-a 광감작제가 ROS를 발생시키는데 어떤 reaction type이 주로 관여하는지, 또한 PDT 시에 고사와 괴사가 어떤 양상으로 진행되는지 살펴보고자 하였다. 이를 통해 향후 PDT에 사용하기 위한 광감작제를 개발할 때 중점을 두어야 할 요소를 밝혀 보고자 하였다.

재료 및 방법

광감작제 및 레이저
   금호 생명과학연구소에서 제조한 9-HpbD-a 광감작제를 사용하였다. 녹조류의 클로로필을 산화반응과 산처리를 통해 10-hydroxypheophytin a 유도체로 만든다. 이를 유기용매로 추출한 10-hydroxypheophytin과 10-hydroxypheo-phytin a 유도체를 유기합성한 후 안정된 구조이며 동시에 대량 수율이 가능한 9-HpbD-a를 추출하였다(Fig. 1).
   레이저는 새로운 광감작제가 최대 흡수 스펙트럼을 보이는 660 nm 다이오드 레이저(Golden Light, Korea)를 사용하였다.

세포배양
   인체 두경부 세포주인 AMC-HN3 세포주를 RPMI-1640(GibcoBRL, USA) 배양액 500 ml에 우태혈청(GibcoBRL, USA) 50 ml와 antibiotic-antimycotic solution(Gibco, BRL) 5.5 ml를 섞은 세포배양액으로 세포배양 플라스크(Nunc, Denmark)를 이용하여 5％의 CO₂와 95％공기가 공급되고 적절한 습도와 37℃의 온도가 유지되는 배양기(Thermo Forma, USA)에서 배양하였으며 세포의 모양을 inverted microscope(Olympus CK40, Japan)을 통하여 관찰하였다. 세포들은 플라스크 바닥에 부착하여 자랐으며 트립신(GibcoBRL, USA)처리 후 계대배양하였다.

PDT 시 레이저 조사 조건
   본 연구에서는 9-HpbD-a의 최대 광흡수도를 보이는 파장인 660 nm 다이오드 레이저(Golden Light, Korea)를 사용하였다. Ahn 등8)의 연구에 의하면 9-HpbD-a를 사용한 PDT에서 최대효과가 나타나는 레이저 조사 시간은 30분(3.2 J/cm²)이었고, 광감작제를 투여한 후 레이저 조사 시간까지의 배양시간은 최소 6시간 이상이다. 이에 따라 본 연구에서의 레이저 조사 시간은 30분, 배양 시간은 8시간으로 정하였다.

CaspACE assay
   미국 Promega사의 CaspACE assay kit를 이용하여 대조군과 9-HpbD-a만 처리한 군과 9-HpbD-a와 PDT를 시행한 실험군에서 caspase activity를 측정하였다.
   초대배양이나 계대배양하여 세포가 배양용기의 바닥에 포화(confluence)되면, 배지를 제거한 후 트립신을 이용하여 세포를 harvest하여 5℃ 1000 rpm으로 5분간 원심분리한 후 60 mm dish에 5×10⁵ cells/ml씩 4 ml로 세포를 분주하여 24시간 동안 5% CO₂, 37℃ 배양기 내에서 배양하였다.
   24시간 후 FBS가 포함된 DMEM 배지로 교환해주고 9-HpbD-a를 처리한 후 30분 후에 배지를 교환하고 660 nm laser를 30분간 조사하였다. 16시간 후 트립신을 이용하여 채취하고 4℃ 1400 rpm으로 10분간 원심분리한 후 108 cells/ml로 cell lysis buffer를 넣고 얼음에 15분간 얼리고 5분간 warm bath에 녹이는 과정을 2차례 반복한 후 4℃ 1500×g으로 20분간 원심분리하였다. 세포 추출액에 pNA 기질을 넣고 33℃에서 4시간 결합하였다. 405 nm에서 ca-spase 활성을 ELISA reader를 이용하여 측정하였다.

Calcium uptake measurement by Confocal microscopy(calcium green-1)
   공초점 레이저주사 현미경(Confocal laser scanning mi-croscopy)를 이용하여 세포질내 칼슘 농도의 증가를 알아보았다. 앞의 실험과 동일한 조건으로 배양한 후 PDT를 시행하였다. Gelatin 코팅을 한 2 cc glass bottom dish에 2×10⁵ cells을 접종한 다음 48시간 후에 배지를 칼슘이 들어있지 않은 HBSS 배지로 교환한 후 각 실험군에 9-HpbD-a를 농도별로 처리하고 3시간과 5시간 동안 5% CO₂, 37℃ 배양기 내에서 배양하였다. Calcium green-1 시약을 1시간 동안 처리한 후 Argon laser를 이용하여 488 nm로 ex-citation시키고, ×400 영상으로 관찰하였다.

공초점 레이저주사 현미경을 통해 광감작제와 ROS의 관찰 
   공초점 레이저주사 현미경을 이용하여 PDT 후 광감작제와 세포질내 ROS 농도의 증가를 관찰 하였다. 앞의 실험과 동일한 조건으로 배양한 후 PDT를 시행하였다. 또한 동일한 실험군으로 구성하였다. General ROS를 염색할 수 있는 H2DCF-DA와 mitochondrial ROS를 염색할 수 있는 Dihydrorhodamine-123 시약을 1시간 동안 처리한 후 Argon laser를 이용하여 488 nm로 excitation시키고, ×400 영상으로 관찰하였다.

Reaction type of ROS
   광감작제가 ROS의 발생시키는 방법을 알아 보기 위해 MTT assay 방법¹⁶⁾을 이용하였다. 지수 성장시기의 각 세포주 들을 10⁵ cells/ml이 되게 배지로 희석한 후 96 well plate에 well 당 100 μl씩 분주하고 24시간을 5％ CO₂, 37℃가 유지되는 항온 항습기에서 배양하였다. 그 다음 광감작제(75 μg/ml) 100 μl를 세포배양 배지로 희석하여 첨가하고 pH 7.3의 DPBS(Hyclone, USA) 용액으로 2 fold-dilution을 통하여 광감작제의 농도를 줄여나갔다.
   PDT만 시행한 대조군과 scavenger를 전처치 후 PDT를 시행한 실험군으로 나누어 실험을 하였다. Type Ⅰ reaction을 차단할 수 있는 D-mannitol을 40 mM, 80 mM 두 군으로 나누어 전처리하였으며 type Ⅱ reaction을 차단할 수 있는 Sodium azide를 5 mM, 10 mM 두 군으로 나누어 전처리하였다.
   72시간을 배양한 후 각각의 well에 50 μl씩 pH 7.3의 DPBS에 녹인 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 용액(2 mg/ml, Sigma)을 첨가하고 4시간 동안 37℃가 유지되는 5％ CO₂ 항온 항습기에서 배양하였다. 배양 후 각 well의 배지를 모두 제거하고 여기에 150 μl의 DMSO(Dimethylsulfoxide：KANTO, Japan)를 첨가한 후 formazan을 잘 용해시키기 위해 mi-croplate mixer(Amersham, UK)로 10~20분간 흔들어 주었으며 microplate reader(BIO-RAD 550, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생존율은 다음의 식을 이용하여 측정하였으며 광감작에의 농도마다 4개의 well의 평균 흡광도 값을 계산하여 결과로 사용하였다.

   Cell viability(%)=   Mean optical density in test well
   Cell viability(%)=--------------------- ×100
   Cell viability(%)= Mean optical density in control well

결     과

CaspACE assay
   대조군의 caspase 흡광도보다 PDT 후 4시간째에 3.22배의 흡광도를 보였으며 8시간째에서는 1.06배, 12시간째에서는 0.68배의 흡광도를 보였다. 이는 PDT 후에 세포사가 고사의 과정을 거친다는 것을 의미하며 PDT 후 약 4시간째에 고사가 가장 활발히 일어나는 것을 말해 준다(Fig. 2).

Calcium uptake measurement by Confocal microscopy
   대조군과 9-HpbD-a를 농도별로 처리한 실험군에서 관찰하였으며 9-HpbD-a가 2.3 μg/ml, 1.1 μg/ml일 때 보다 0.51 μg/ml일 때 가장 뚜렷하게 보였다. 이는 칼슘의 세포내 유리가 9-HpbD-a가 0.51 μg/ml일 때 가장 활발하다는 것을 말해 주고 있으며 이때 고사가 가장 활발히 일어난다고 생각할 수가 있다(Fig. 3).

공초점 레이저주사 현미경을 통한 광감작제와 ROS의 관찰
   PDT 후 세포질내 광감작제와 ROS 농도의 관계를 보기 위해 공초점 레이저주사 현미경을 이용하여 관찰하였다. General ROS를 염색하는 H₂DCF-DA의 분포를 보았으며 세포질 내에 축적 되는 양상을 관찰할 수 있었다. 또한 같은 위치에서 광감작제의 자체 형광이 분포함을 관찰하였다. PDT 후 H₂DCF-DA와 광감작제의 자체형광의 분포가 거의 일치 하는 것을 볼 수가 있다. PDT를 시행하지 않은 군에서는 H₂DCF-DA는 보이지 않고 광감작제의 자체형광만 보인다(Fig. 4). Pseudocolor grading 처리를 한 후 관찰을 하였더니 더 명확하게 PDT 후 광감작제의 위치와 ROS의 위치가 일치함을 알 수가 있었다(Fig. 5).
   Mitochondrial ROS를 염색하는 Dihydrorhodamine-123 시약을 처리한 후 관찰하였다. 이득값 차이로 인해 덜 선명 하지만 PDT 후 미토콘드리아에서도 역시 ROS가 발생한다는 것을 볼 수가 있었다(Fig. 6).

Reaction type of ROS
   Type Ⅰ reaction을 차단할 수 있는 D-mannitol을 전처리한 군에서는 대조군과 비교 시 세포 생존율에서 유의하지 않은 차이를 보였다(Fig. 7). Type Ⅱ reaction을 차단할 수 있는 Sodium azide를 전처리한 군에서는 대조군과 비교시 유의한 세포 생존율 증가를 보였다(Fig. 8).
   이는 AMC-HN3에서 9-HpbD-a를 이용한 PDT 후에 type Ⅱ reaction을 통해 ROS가 발생한다는 것을 의미한다.

고     찰

   이전까지는 Hematophorphyrin 유도체인 Photofrin 등이 PDT의 광감작제로 널리 쓰여 왔다. 하지만 이 광감작제는 약 10주까지 광독성이 지속되고 조직침투가 떨어지는 파장에서 활성화되어 점차 사용이 줄고 있는 추세이다.⁴⁾ 단국대학교 의학레이저센터와 금호 생명과학연구소에서 공동 개발한 9-HpbD-a는 녹조류의 porphyrin 유도의 광감작제이며 PDT의 새로운 광감작제로써 광각받고 있다. 저자는 본 연구에서는 AMC-HN3 세포주에 대한 9-HpbD-a PDT 후 세포사가 발생하며 그 양상이 고사 혹은 괴사로 진행되는 것을 관찰하였다. 또한 ROS와 세포내 칼슘이 이 과정에 관여함을 관찰하였다.
   빛을 조사하면 광감작제가 기저 상태(S0)에서 첫 번째 여기 상태(S1)로 여기된 후 intersystem crossing을 통해 triplet 상태(T1)로 변형된다. 이 triplet 상태는 두 가지 방법으로 반응하는데 이를 type Ⅰ과 type Ⅱ reaction으로 나누어 볼 수 있다.⁵⁾ Type Ⅰ reaction의 기전은 hydrogen atom abstraction 혹은 여기된 상태의 광감작제와 용매 혹은 다른 광감작제와 electron-transfer reaction으로 반응하여 free radical을 생성한다. 이의 대표적인 것들로는 hydroxyl radical 혹은 superoxide anions 등이 있다. 반면 type Ⅱ reaction은 여기 상태의 광감작제와 산소 분자 사이에 에너지의 전달로 인해 singlet oxygen을 생성한다. 일반적으로 type Ⅱ reaction이 선호되는 환경은 oxygenated system이고 type Ⅰ reaction이 선호되는 환경은 hypoxic condition이나 극성의 환경으로 알려져 있다.⁵⁾ 실험결과에서 singlet oxygen quencher인 Sodium azide를 처리하였을 때 세포의 생존율이 hydroxyl radical scavenger인 D-mannitol을 처리했을 때보다 유의하게 높았다. 이를 바탕으로 AMC-HN3 세포주에 대한 9-HpbD-a PDT에서 주된 ROS 발생 기전이 type Ⅱ임을 알 수 있었으며, 이는 AMC-HN3 cell에서 세포 내 주된 환경이 oxygenated system 임을 시사한다.
   PDT는 in vitro 혹은 in vivo에서 괴사 과정이나 고사 과정을 통해 세포사를 일으킬 수 있다. PDT를 통해 trigger되는 세포사의 기전은 사용된 광감작제의 종류, 빛의 조사 환경, 조직의 산소화 정도와 세포의 종류 등등에 의해 결정 된다.^6,7) 최근의 연구에 의하면 동일한 세포에 대한 PDT 후 세포사의 과정은 레이저 조사세기에 따라 고사와 괴사가 동시에 진행되며 그 비율이 다르다. 또한 세포의 종류에 따라서 세포사가 일어날 때 고사와 괴사가 진행되는 비율이 다르다. 돌연변이형 p53유전자를 가진 인체 방광 암종의 경우 LD50(50％ lethal dose)의 광량에서는 고사가, LD90의 광량에서는 괴사를 통한 세포파괴가 더 활성을 갖는 것으로 보고 되고 있다.⁷⁾ 본 연구에서도 이와 같은 현상을 관찰할 수 있었는데 낮은 광감작제 농도에서는 고사가, 높은 광감작제 농도에서는 괴사가 주된 세포사멸 기전임을 확인하였다.
   광감작제의 세포내 분포는 감작제의 물리화학적 성질에 따라 차이를 나타내는데 흔히 사용되는 HpD류의 Photofrin, Photogem과 같은 친지질성 감작제나 5-ALA-induced protoporphyrin Ⅸ 등은 주로 사립체, 소포체막, 핵막 그리고 세포핵 주변에 축적되는 반면 A1PcS4, TPPS 등의 친수성 감작제는 세포막을 투과하는 성향이 적기 때문에 주로 간질 내나 종양의 혈관기질에 축적된다.⁶⁾ 본 연구에서 사용된 9-HpbD-a는 친수성 광감각제로 자체 형광을 관찰해 본 결과 간질 내에 축적된 것을 볼 수 있어 이를 확인할 수가 있었다.
   미토콘드리아는 고사의 과정에 있어서 중요한 역할을 하는데 미토콘드리아에서 Cyto C가 방출되게 되면 Apaf-1이 형성되는 것을 trigger하게 되고 procaspase-9이 apop-tosome으로 변화시키고 이것이 autocleave되면서 활성화된 Caspase-9이 되고 이는 procaspase-3을 활성화 시켜 Caspase-3를 형성하게 되고 apoptosis를 trigger하게 된다. 일반적으로 알려져 있기로는 singlet oxygen이나 hy-droxyl radical은 모두 Cyto C release를 일으킨다고 되어 있다.^9,10) 하지만 본 실험에서는 type Ⅱ reaction 즉 sing-let oxygen이 주된 반응으로 나와서 AMC-HN3 세포주에서 9-HpbD-a를 사용한 PDT에서는 미토콘드리아의 역할이 비교적 적음을 알 수가 있었다.
   칼슘은 이차 전령으로써 세포가 고사로 가는 과정을 조절 하는 기능을 한다고 알려져 있다.^11,12,13) 여러 연구를 통해 Ca⁺⁺의 농도 증가가 PDT 후 세포가 고사, 혹은 괴사로 가는 것과 관련이 있다는 것이 증명되어 있다.^14,15) 본 연구에서도 공초점 레이저주사 현미경 영상을 통해 PDT 후의 세포 내 Ca⁺⁺의 농도를 관찰하였으며 Calcium green-1으로 세포 내 칼슘을 염색하였다. 고사가 일어나는 광감작제 농도에서 유의하게 증가된 칼슘 농도를 관찰할 수가 있었다.
   결론적으로 AMC-HN3 세포주에 대한 9-HpbD-a PDT에서 세포사 과정에 고사 혹은 괴사가 농도에 따라 다르게 관여함을 알 수 있다. 발생되는 ROS 중에서 특히 singlet oxygen이 주로 발생되며 이것이 세포사의 triggering에 주된 역할을 한다. 즉 세포 내 환경이 산소가 풍부한 환경이라는 것이고 type Ⅱ reaction이 ROS 발생의 주된 기전이라는 것을 알 수 있었다.
   PDT 후에 세포 내에서 ROS가 발생하였는데 공초점 레이저주사 현미경상 광감작제가 세포의 간질 내에 축적 되었으며 동일한 위치에서 ROS가 발생 하는 것을 관찰하였다. 이로써 PDT를 시행할 때 광감작제의 세포 내 침투 부위가 곧 ROS가 발생하는 부위임을 증명 하였다. 이 실험은 향후 연구에서 세포 내에 특정한 부위에 ROS를 발생시키고자 할 때 광감작제의 흡수가 되는 부위를 조정하면 된다는 실험적인 근거가 된다.

결     론

   9-HpbD-a를 사용한 PDT 후 광감작제가 흡수된 곳에서 ROS를 발생하였다. 이는 세포 내 광감작제의 target을 정해 치료 효과를 꾀할 수 있다는 것을 말한다. 또한 ROS를 발생시키는 기전은 Type Ⅱ reaction이었다. 이는 세포 내 환경이 산소가 풍부한 환경이라는 것을 말한다. PDT 후에 4시간째에 가장 활발하게 고사가 진행하였다. 임상에서 적용이 가능한 정도의 저농도의 9-HpbD-a에서 PDT의 세포사 기전은 괴사보다는 고사가 주를 이룬다. 이 결과는 향후 9-HpbD-a를 이용한 PDT의 임상 적용의 기본 자료로 활용될 수 있을 것으로 기대 된다.

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