교신저자：이흥만, 152-703 서울 구로구 구로동 80번지  고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   구강과 타액선관은 다양한 생물학적, 화학적 및 물리적인 자극에 노출되어 있으며 타액 흐름에 의하여 단순히 물리적으로 세척되는 기전에서부터 복잡한 숙주의 면역 반응에 의하여 방어기전이 이루어 진다. 지속적인 외부 자극에도 불구하고 이러한 방어기전의 상호작용에 의하여 정상적인 구강 및 타액의 생리작용이 유지된다.
   항균 펩티드와 단백질은 다양한 인체 장기에서 중요한 방어 역할을 함으로써 인체를 침범한 세균이나 정상 세균총을 사멸시키고 소멸시킨다.¹⁾ 인체에서 발견된 항균 펩티드는 타액 histatin, lactoferricin과 defensin 등이 있고 Cathelicidin계통 중 유일하게 hCAP18 또는 LL-37만이 인간에서 확인되었다.²⁾ Cathelicidin은 주로 호중구에서 발현되며³⁾⁴⁾⁵⁾ 고환, 골수, 폐, 구강, 혀, 식도, 자궁경부 및 질의 편평상피에서 발현된다.²⁾³⁾ 그러나 외부와 노출된 구강 점막이나 타액선에서 발현될 가능성이 있으나 현재까지 인간 타액선에서 Cathelicidin이 발현된다는 보고는 없었다. 본 연구에서는 인간 타액선에서 Cathelicidin 발현을 관찰하고, 만성 타액선염 환자와 정상인의 타액선에서 Cathelicidin의 발현을 비교하고자 하였다. 

재료 및 방법

조직표본
   만성 타액선염 환자 10명(남자 5명, 여자 5명, 평균연령 32.7세)의 타액선 조직과 양성 타액선종양 환자 10명(남자 5명, 여자 5명, 평균연령 35.2세)의 정상 타액선조직에서 조직 표본을 채취하였다. 채취된 조직의 일부분은 액화질소에 즉시 냉동시키고 mRNA 발현을 연구를 위하여 -70℃에서 저장하였고, 조직의 나머지 부분은 4% paraformaldehyde(pH 7.4)로 4℃에서 8시간 고정한 후 면역조직화학염색을 위해 파라핀에 포매하였다.

RNA 추출과 역전사-중합효소연쇄반응
   채취한 조직은 1 mL의 Trizol 시약(GibcoBRL, Tuscon, AR)에서 균질화하여 RNA를 추출하였다. 각 조직에서 추출한 모든 RNA는 2.5 U의 Moloney murine leukemia virus 역전사효소(GibcoBRL)와 50 pM의 random hexanuclotide 혼합액 20 μL로 42℃에서 60분간 역전사를 시행하였다. 알려진 염기서열에 따라 시발체(Bioneer사, 대전)를 제작하였다. 중합효소연쇄반응을 위한 올리고핵산 시발체로 LL-37은 5'-GAA GAC CCA AAG GAA TGG CC-3'와 5'-CAG AGC CCA GAA GCC TGA GC-3'이었고, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 은 5'-GTG GAT ATT GTT GCC ATC AAT GAC C-3'와 5'-GCC CCA GCC TTC ATG GTG GT-3'이었다. cDNA의 증폭은 94℃에서 45초간, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분간 35주기 반응시킨 후 최종 72℃에서 7분간 반응을 연장하였다. 중합효소연쇄반응 산물의 특이도는 예상되는 크기, 제한 효소 및 DNA 염기서열분석을 통해서 확인하였다. 반응의 특이도를 높이기 위하여 위하여 음성 대조군은 RNA를 제거하거나 역전사 효소가 없는 RNA를 사용하였고, 양성 대조군으로는 Cathelicidin이 발현된다고 알려진 폐조직으로부터 mRNA를 추출하여 사용하였으며 RNA의 질을 확인하기 위하여 모든 표본에서 GAPDH 발현을 분석하였다. 역전사-중합효소연쇄반응 결과를 반정량적으로 분석하기 위하여 겔영상을 스캔하고 NIH image software(National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 이용해 중합효소연쇄반응 산물의 양을 반정량적으로 측정하였다. Cathelicidin의 발현 강도와 GAPDH의 강도에 대한 비를 측정하여 겔영상에서 각 띠의 상대 강도를 결정하였다. 

Cathelicidin 단백에 대한 면역조직화학적 염색
   파라핀 블록을 5 μm 두께로 자르고 자일렌으로 파라핀을 제거하고 100% 알코올로 수화시키고 75% 알코올로 다시 수화시켰다. Paraformaldehyde로 고정된 타액선 조직으로부터 얻은 파라핀 절편은 내인성 과산화효소를 차단하기 위해 3% H₂O₂/methanol으로 처리하고 Cathelicidin에 대한 다클론항체(Dr Ole Sorenson, Granulocyte Research Laboratory, National University Hospital, Copenhagen, Denmark으로부터 제공)를 1：100 희석액으로 4℃에서 8시간 반응시켰다. 발색반응은 3, 3’diaminobenzidine(Sigma, St. Louis, MO)를 이용하였다. 음성대조군은 일차 항체 대신에 인산완충용액 혹은 비면역혈청(non-immune serum) IgG를 이용하여 위와 같은 방법으로 실험을 시행하였다.

통계분석
   자료는 Mean±SD로 표현하였고 두 군간의 양적 자료에 대한 비교는 Mann-Whitney U test로 분석하였다. 두 군의 차이는 p<0.05일 때 유의한 것으로 정의하였다. 

결     과

역전사-중합효소연쇄반응
   역전사-중합효소연쇄반응 검사 결과에서 타액선 조직에서 Cathelicidin에 대한 mRNA가 발현되었다. 타액선 조직에서 나온 중합효소연쇄반응 산물은 시발체로부터 예상되었던 570 bp을 가지고 있었으며, 같은 크기의 산물이 양성 대조군에서도 발현되었다(Fig. 1). 만성 타액선염 조직과 정상 타액선 조직에서 Cathelicidin mRNA의 발현량에는 유의한 차이가 있었으며, Cathelicidin/GADPH mRNA 비율은 만성 타액선염에서 2.69±0.28이었고 정상에서는0.36±0.14으로 두 군간에는 유의한 차이가 있었다(p<0.05, Fig. 2).

Cathelicidin 단백에 대한 면역조직화학적 염색
   Cathelicidin은 만성 타액선염(Fig. 3A)과 정상 타액선(Fig. 3B)의 염증세포와 관세포의 세포질에 국한되어 면역 조직화학적 염색이 되었으나, 선포세포에서는 면역 조직화학적 염색이 되지 않았다. 음성대조군에서는 면역 조직화학적 염색을 보이지 않아 Cathelicidin 항체의 특이성을 확인할 수 있었다(Fig. 3C).

고     찰

   선천면역(innate immunity)은 강력한 병원균의 침범으로부터 숙주 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 하며 고도로 특수화된 적응면역(adaptive immunity)과 달리 선천면역계는 빠르고 비특이적인 반응으로 일차적 방어를 담당한다. 광범위 항균력을 보이는 항생 펩티드는 선천면역계에 속하여 숙주방어기전에서 중요한 역할을 하며 미생물을 광범위하게 사멸시키는 효과적인 분자이다.¹⁾ 이러한 펩티드는 기도나 위장관의 상피세포나 포식세포와 같이 미생물에 노출되어 있는 부위에 많이 존재한다. 
   1980년대 곤충에서 cecropin이 분리되고⁶⁾ 토끼 대식세포에서 defensin이 처음으로 분리되었고,⁷⁾ 자연계에서 많은 항생 펩티드가 발견되었으며 인간에서는 타액 histatin, lactoferricin, 6α-defensin, 2β-defensin, human cationic antimicrobial protein 등을 포함해 많은 항생 펩티드가 발견되었다.²⁾ hCAP18(human cationic antimicrobial protein of 18 kd)은 인간의 호중구에서 존재하는 단백질로서 Cathelicidin군의 항균 단백질에 속하며 이 군의 단백질은 공통된 N말단 염기서열과 매우 다양한 항균력을 갖는 양전위의 C말단으로 구성되어 있다. 이러한 일정한 N 말단을 갖는 항균 펩티드군을 Cathelicidin라고 불리며⁸⁾ 소의 호중구에서 4개와 돼지의 호중구에서 9개의 Cathelicidin이 확인되었다. 그러나 인간의 호중구에서는 hCAP18만이 발견되었다.³⁾⁴⁾⁵⁾ hCAP18은 골수의 전호중구, 호중성골수세포, 호중성후골수세포에서 합성되며 성장한 호중구의 과산화효소 음성 과립에 저장되며 합성된 hCAP18은 18-kd의 전단백질로서 5-kd C말단 절편의 LL-37으로 분할되어 생물학적 반응을 일으킨다.⁹⁾¹⁰⁾ 
   Cathelicidin 혈장 농도는 1.18 μg/mL으로 이는 호중구의 다른 과립 단백질보다 수배 이상 많으며, Cathelicidin은 혈장에서 고분자 복합체로 존재한다.¹¹⁾ Cathelicidin으로부터 proteinase 3에 의하여 세포밖에서 항균 펩티드인 LL-37이 분할되며¹²⁾ cysteine이 없는 펩티드인 LL-37은 양친매적 성질을 갖는 α나선식 입체형태로서 지질다당류에 결합하는 성질이 있어 C말단영역을 통해 광범위한 종류의 병균에 대해 항균 효과를 나타낸다.¹³⁾¹⁴⁾ Cathelicidin의 항균력은 lactoferrin, lysozyme과 상승작용을 일으키며,¹⁴⁾ Cathelicidin 촉진유전자 부위는 전사를 일으키는 인자, 급성기반응 인자 및 Interleukin-6의 핵인자에 강하게 부착한다.¹⁰⁾ 또한 Interleukin-6은 Cathelicidin 유전자 발현을 조정하는데 중요한 역할을 한다.¹⁵⁾¹⁶⁾ 
   본 연구에서는 인간 타액선에 항균 펩티드 Cathelicidin mRNA와 단백이 존재함을 밝혔으며 Cathelicidin은 주로 관세포에서 관찰되어서 타액선 자체의 방어 물질 중 하나라고 생각된다. 타액선의 관은 구강 내로 열려 있기 때문에 세균, 바이러스, 진균의 침범에 노출되어 있고 따라서 역행성 감염이 발생할 수 있고, 특히 관이 막혔을 때에는 감염의 위험이 높다. Cathelicidin은 침으로 분비되어 작용하거나 구강 세균이 침입하는 입구에서 작용하여 숙주의 일차 방어 작용을 한다. 
   면역조직화학적 염색에서 Cathelicidin이 타액선의 관세포에 주로 발현 되었다. 이는 폐, 구강, 혀, 식도, 질의 편평상피에서 발견된 Cathelicidin이 지속적으로 미생물이 들어오는 위치인 타액선에도 지속적으로 발현됨을 의미한다.²⁾⁴⁾ 역전사-중합효소연쇄반응에서 Cathelicidin의 mRNA는 모든 만성 타액선염에서 발견되었으나, 정상 타액선에 비해 발현이 증가되었다. 이러한 사실은 Cathelicidin이 지속적으로 발현될 뿐만 아니라 염증에 의해서 유도된다는 것을 의미한다.¹⁷⁾ 
   최근 연구에 의하면 인간 Cathelicidin은 호중구, 단핵구, CD4 T 림프구에 대하여 화학주성이 있으며, Cathelicidin의 화학주성은 formyl peptide receptor-like 1에 의해 매개되며,¹⁸⁾ 숙주의 선천면역과 적응면역을 가동 시키고 증폭시키는데 관여한다.

결     론

   본 연구에서는 인간 타액선에 Cathelicidin이 국소적으로 발현되며 염증시 발현이 상승됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 역행성 감염의 방어에서 Cathelicidin의 중요성을 암시한다. 
   타액선에서 발현되는 Cathelicidin에 대한 기능과 Cathelicidin의 발현 기전에 관하여 추후에 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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