서     론

   호산구는 알레르기성 비염, 기관지 천식 같은 알레르기성 질환과 기생충 감염, 비용 조직에서 특징적으로 증가되는 염증세포로 eosinophil peroxidase(EPO), major basic protein(MBP), eosinophil cationic protein(ECP), eosinophil derived neurotoxin(EDN) 같은 단백물질을 분비하여 조직을 손상시키고 각종 사이토카인을 분비하여 국소 염증 반응을 유지, 촉진시켜 준다.¹⁾²⁾ 조직 호산구의 증가는 골수에서 호산구의 생산이 증가되고, 혈중 호산구가 표적기관으로 많이 이동하거나 조직으로 이동한 호산구의 생존능력이 길어지는 등 여러 가지 기전이 관여한다. 그 중 염증 반응이 있는 곳으로 이동이 증가되고, 조직 내에서 호산구의 생존이 길어지는 것이 두 가지 주요 기전으로 알려져 있다. 특히 interleukin-3(IL-3), interleukin-5(IL-5), granulocyte-macorphage colony stimulating factor(GM-CSF) 등은 호산구의 이동이 촉진될 뿐 아니라 호산구의 apoptosis를 억제하여 생존 기간(life span)을 연장시켜 준다.^3-5)
   당질스테로이드는 기관지 천식, 알레르기성 비염 및 비용의 약물치료제로 사용되며, 비용 크기를 줄여주고, 수술 후 재발 방지에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이 약제들은 골수에서의 호산구 형성 및 조직으로의 이동을 억제하고, 림프구와 조직 지주세포(supporting cell)에서 분비하는 IL-3, GM-CSF 같은 각종 사이토카인과 호산구 colony stimulating factor의 생산을 억제함으로써 호산구의 수명을 줄여준다. 또 호산구 세포질 내 스테로이드 수용체에 직접 작용하여 생존촉진인자의 생산과 미성숙 호산구의 생존 및 분화를 억제하고, apoptosis 기전을 활성화 시켜 조직 속으로 침투한 호산구 수를 감소시킨다.⁶⁾⁷⁾ 이와같이 조직내 림프구와 호산구의 수를 줄일 뿐 아니라 세포의 활성화를 억제하여 염증 반응을 저하시킨다.
   비용은 조직내 화학매개물질 구성의 변화로 호산구 및 염증 세포가 증가되며, 호산구 apoptosis의 억제는 지속적인 조직 호산구수를 증가시켜 조직 변성을 유지, 강화하여 비용의 성장에 관여한다. 알레르기성 비염과 비용의 치료에 사용되는 국소 스테로이드는 호산구 등의 염증세포에 직접 작용할 뿐 아니라 상피세포에서 분비되는 화학매개물질의 분비를 억제하고 apoptosis를 유도하여 조직 호산구 증가를 억제하는 것으로 알려졌다.⁸⁾⁹⁾ 이에 저자들은 비용 상피세포 배양액으로 자극된 호산구를 임상에서 흔히 사용되는 Dexame-thasone(Dexa), Triamcinolone(Tri), Budesonide(Bud), Fluticasone(Flu)으로 처리하여 이들 당질스테로이드 제재가 호산구의 생존 및 apoptosis에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

비용 상피세포의 분리 및 Human epithelial conditioned media(HECM)의 생산

   비용조직은 비내시경 수술을 시행한 환자에서 채취하여 실험에 사용하였다. 환자 선택은 알레르기성 비염이 동반되지 않고, 수술전 4주 이상 항생제, 항히스타민제, 국소 및 경구용 스테로이드제재 등의 약물 치료를 시행하지 않은 예에서 시행되었다. 채취한 비용 조직을 penicillin(Pc) 100 UI/ml, streptomycin(SM) 100 μg/ml, amphotericin-B(Amp-B) 2 μg/ml를 포함한 Ham's F-12 배양액(GIBCO, Grand Island, NY, USA)으로 2~3회 세척 후 dispase(GIBCO, Grand Island, NY, USA)와 처리한 다음 37°C에서 trypsin/EDTA로 10분간 배양하여 상피세포를 박리하였다.
   박리된 세포들을 10 mm 접시에 1시간 두어 섬유모세포, 근육세포와 혈관 내피세포를 제거하였으며, 이렇게 얻어진 상피세포는 Pc, SM, Amp-B, glutamine 150 μg/ml, transferrin 5 μg/ml, insulin 5 UI/ml, epithelial growth factor 25 ng/ml, endothelial cell growth supplement 15 μg/ml, triiodothyronin 200 pM, hydrocortisone 100 nM, fetal calf serum 15%를 포함한 배양액으로 37°C, 5% CO2에서 배양하였다. 상피세포의 confluent monolayer가 형성되면 배양액을 10% fetal bovine serum과 Pc, SM, Amp-B를 포함한 RPMI 1640으로 바꾸어 48시간 배양 후 상등액을 얻어 ­70°C에 냉동 보관하였다.

호산구의 분리 및 배양

   호산구는 정상인 말초 혈액을 항응고제인 anticoagulant citrate dextrose(ACD) 용액에 잘 혼합하여 Percoll액 위에 놓고 원심분리하여 과립구와 적혈구가 섞여있는 층을 분리한 후 적혈구는 NH 4Cl-EDTA를 이용하여 hypodense lysis로 제거하였다. 이렇게 얻어진 호산구와 호중구를 phosphate buffer solution(PBS)으로 세척하고 항-CD16 항체로 30분간 처리한 후 magnetic cell separation method(StemCell Technologies Inc, Canada)로 호산구를 분리하였다. 호산구의 순수도는 Randolph 염색을 이용하여 95%이상을 확인하였으며, trypan blue를 이용한 viability 검사상 98%이상의 생존율을 보였다.
   10% FBS를 포함한 RPMI 1640에 2×10⁶/ml의 호산구를 넣고 10^-5-10^-8 M의 Dexa, Tri, Bud, Flu으로 한시간 전 처리 후 10% HECM을 넣어 37°C, 5% CO₂에서 배양하여 배양 1, 2, 4, 7일째 호산구의 생존율 및 apoptosis를 분석하였다. 대조 실험으로 10% HECM만으로 배양한 경우와 RPMI 1640 배양액만으로 배양하여 호산구의 상태를 비교하였다. 세포 생존율은 Promega사의 MTS분석법을 이용하였으며, apoptosis는 항 active caspase-3 항체(Pharmingen, San Diego, USA)를 이용하여 검사하였다. 검사 과정을 살펴보면 세포를 -20°C에서 10% ethanol로 15분간 고정한 후 0.05% Tween 20을 포함한 PBS(TPBS)로 세척하고 20 μl의 항 active caspase-3로 30분간 반응시켰다. 다시 TPBS로 세척하고 35 μm의 nylon mesh로 filter한 후 flow cytometry를 이용하여 apoptosis 유발 세포를 측정하였다.

통계 분석

   그룹간의 생존율 및 apoptosis는 Mann-Whitney rank sum test를 이용하여 비교하였으며, 약제 농도에 대한 결과는 Kruskal-Wallis test법을 이용하여 분석하였다. 통계적 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

호산구 생존율
   MTS assay를 이용한 survival 분석에서 배양 2일째부터 배양액만으로 처리된 호산구의 생존율이 HECM으로 처리된 호산구 생존율의 43.24±3.25%로 낮은 생존율을 보였으며, Fluticasone은 10^-5과 10^-6 M에서 배양 4일과 7일에 다른 스테로이드 제재에 비해 유의하게 생존율이 떨어졌으나(p<0.05), 다른 세 가지 약제간의 생존율에는 차이를 보이지 않았다. 스테로이드의 농도가 높아지고 배양 시간이 길어짐에 따라 생존율이 떨어졌으나 Fluticasone 10^-5 M이 4일과 7일에 다른 농도보다 낮은 생존율을 보인 것을 제외하고는 통계적 의의는 찾을 수 없었으며, 특히 배양 7일째는 HECM으로 처리된 호산구의 생존율이 떨어져 약제로 처리된 호산구의 상대적 생존율은 도리어 증가되었다(Fig. 1).

호산구 caspase-3 발현
   Caspase-3를 이용한 apoptosis 분석에서 Dexamethasone, Budesonide, Fluticasone은 배양 2일부터 평균 35.43±2.42%, 26.58±5.01%, 26.37±4.39%의 양성률을 보여 10.52±3.75%의 HECM에 비해 유의하게 높게 나타났으나(p<0.05), Triamcinolone은 8.42±2.14%로 apoptosis가 촉진되지 않았다. 배양 4일부터 Triamcinolone을 비롯한 모든 당질스테로이드에서 높은 caspase-3 양성률을 보였다. Triamcinolone의 경우 시간이 경과함에 따라 caspase-3의 발현이 증가되었으나, 다른 세 약제의 경우 시간에 따른 변화가 없었으며 동일 약제의 농도에 따른 apoptosis 양성률은 네 군 모두에서 차이를 보이지 않았다(Fig. 2).

고     찰

   Apoptosis는 세포가 환경 변화에 적응하고, 질병의 발생을 억제하며 개체의 발현을 위해 일어나는 생리적 현상으로 cell shrinkage, chromatin condensation, nuclear segmentation, apoptotic body 형성 등의 변화를 보인다. 괴사 반응의 경우 세포들이 각종 세포 단백 물질과 세포 독성 물질을 분비하여 염증 반응을 유발 악화시키는 것과는 달리 apoptosis가 일어난 세포들은 세포막의 손상 없이 탐식 세포에 의해 제거됨으로 염증세포의 수를 줄이고 염증 반응을 억제, 개선시킨다.^10-12)
   비점막 상피세포는 GM-CSF, IL-8, TNF-α 등 각종 화학물질을 분비하여 염증세포의 활성화와 이주에 영향을 미치는 등 국소 염증반응에 중요한 역할을 한다. 또한 호산구를 비점막 상피세포 배양액으로 배양한 경우 호산구의 생존기간이 길어지는데 정상 비점막 상피세포 배양액을 사용한 경우 25%의 농도에서, 비용 상피세포 배양액으로 배양한 경우는 10%의 농도를 사용하였을 때 최적의 호산구 생존 연장 효과를 보인다고 한다. 호산구를 스테로이드로 전처리한 경우 세포막을 통과한 약제와 세포질 내 스테로이드 수용체가 결합을 이루어 HECM의 효과가 억제된다고 한다.⁸⁾⁹⁾ 이에 저자들은 호산구를 스테로이드 제재로 1시간 전 처치 후 비용에서 얻어진 HECM 10%를 첨가하여 약제의 효과를 알아보고자 하였다. 저자들의 경우 역시 비용 상피세포에서 얻은 HECM이 호산구의 생존율을 향상시켜 주었으며, 스테로이드를 전처치 한 경우 HECM의 효과가 억제되어 호산구의 생존기간이 감소되었다. 이 결과는 당질스테로이드가 호산구의 수용체에 직접 결합하여 apoptosis를 유발하거나, 비용 상피세포에서 분비된 생존 촉진인자들의 기능을 억제하여 일어난 결과로 생각된다. Mullol 등⁹⁾¹³⁾은 당질스테로이드의 농도가 높을수록 호산구의 생존율이 낮아지는 것으로 보고하였으나, 저자들이 사용한 10^-5-10^-8 M의 농도에서는 농도의 변화와 약제의 종류가 생존율에 영향을 미치지 않았다. 이는 본 실험에서 사용된 약제의 농도가 호산구 생존에 영향을 미치는 최소 농도인 Flu 10^-10 M과 Bud, Tri, Dexa 10^-9 M보다 높은 농도를 사용한 것에 기인할 것이다.

   당질스테로이드의 약효는 지방 용해도, 수용체 결합력, 조직 친화력 및 조직 내에서의 대사 등 여러 가지 인자가 관여한다.¹⁴⁾ 지방 용해도는 비강점막에서의 흡수 속도, 조직 축적도, 수용체와 결합력에 영향을 미치는데 Flu가 Bud의 300배, Tri의 1000배이다. 수용체 결합력은 약의 역가를 결정하며 Flu, Bud, Tri, Dexa의 순으로 강하며, 수용체 결합 후 약제의 반감기는 Flu가 10시간, Bud 5시간, Tri 4시간으로 알려져 있다.¹⁵⁾ 즉 Flu와 Bud가 비교적 높은 효율성과 약효를 보인다. 본 연구 결과 10^-5과 10^-6 M에서 Flu이 다른 스테로이드 제재에 비해 강한 생존 억제효과를 보여 다른 스테로이드 제재보다 약효가 강한 것을 알 수 있었는데, 이는 약제의 역가가 Flu, Bud, Tri, Dexa 순으로 강하다는 보고와 일치하였다.¹⁶⁾
   Caspase-3는 apoptosis 초기에 활성화되어 발현되는 protease의 한 종류이다.¹⁷⁾¹⁸⁾ 배양 2일째 HECM으로 처리된 호산구는 10.52±3.75%에서 caspase-3에 양성이었고, 배양액으로만 처리된 호산구에서는 17.62±5.23%로 나타났다. 따라서 HECM이 apoptosis를 억제하여 호산구의 생존율과 수명이 길어짐을 알 수 있었으며, Flu, Bud, Dexa은 배양 2일째부터, Tri은 4일째부터 통계학적으로 의미 있게 apoptosis를 촉진하였다. 이는 세포막을 통과한 약제가 수용체와 결합하여 DNA의 변화를 유도하고 핵 물질의 변성을 초래하여 이루어진다고 한다.¹⁹⁾ 그러나 사용된 약제의 농도가 호산구의 생존에 미치는 최소 농도보다 높아 농도의 변화가 caspase-3 발현에 영향을 미치지 못하였다. 배양 시간이 길어짐에 따라 caspase-3의 발현이 증가되지 않아, 초기 apoptotic 변화를 일으킨 세포가 괴사성 세포로 변하였을 가능성이 있을 것으로 생각하였다. 이에 저자들은 Dexa로 전 처리된 호산구를 배양 4일과 7일에 annexin-V(Pharmingen, San Diego, USA)와 7-amino-actinomycin D(7-AAD)염색을 같이 시행하여 괴사성 세포의 유무를 확인하였다. 즉 annexin-V에만 염색된 세포는 apoptosis가 진행중이고, annexin V와 7-AAD 모두 염색된 경우는 apoptosis 진행이 거의 끝난 상태이거나 괴사성 변화를 일으킨 세포를 의미한다. 배양 4일과 7일에 시행한 검사에서 annexin V와 7-AAD에 양성을 보인 괴사성 세포는 0.37~1.18%로 caspase-3 양성인 호산구의 대부분이 괴사성 변성이 아닌 apotosis가 일어나고 있는 세포임을 확인할 수 있었다.

결     론

   비용 상피세포에서 분비된 각종 화학 매개물질들은 호산구의 생존능력을 향상시켜 조직 및 비즙 호산구 증가를 유도하지만 당질스테로이드는 조직 지주세포에서 분비된 화학물질의 작용을 억제하고, 호산구의 스테로이드 수용체에 직접 작용하여 호산구의 apoptosis를 촉진시킨다. 당질스테로이드가 조직 내 호산구의 증가를 억제하는 기능은 항염증 효과와 함께 비용 치료의 한 기전으로 작용할 것이다. 네 가지 당질스테로이드 중 Flu이 비교적 강한 효과를 보였으며 Bud, Dexa, Tri의 순으로 호산구의 생존 억제 및 apoptosis를 유도하는 것을 알 수 있었다.

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