| Prognostic Significance of Ki-67 Index and Expression of Cyclin D1 in Squamous Cell Carcinoma of the Larynx and Hypopharynx. |
| Sang Hoon So, Byung Chul Song, Yin Gyo Jung, Young Soo Rho, Hyun Joon Lim, Duck Hwan Kim |
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Hallym University, Seoul, Korea. YS20805@chollian.net
2Department of Pathology, College of Medicine, Hallym University, Seoul, Korea. |
| 후두와 하인두 편평세포암종에서 Ki-67 표지지수와 Cyclin D1 발현의 예후적 의미 |
| 소상훈1 · 송병철1 · 정인교1 · 노영수1 · 임현준1 · 김덕환2 |
| 한림대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실1;병리학교실2; |
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| 주제어:
편평세포암종ㆍKi-67ㆍCyclin D1ㆍ면역조직 화학염색. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Various host and tumor parameters, particularly by the tumor size and lymph node metastasis have been studied in an attempt to evaluate and decide the optimal treatment of the patients with head and neck squamous cell carcinoma. However, it has been necessary that the prognostic parameters can be useful to evaluate the biological behaviors of the malignancy. The Ki-67 is a proliferative marker of tumor cells and cyclin D1 is a cell cycle regulator essential for G1 phase progression. Loss of regulation of cyclin D1 is likely to contribute to tumor development. The author evaluated the prognostic significance of cyclin D1 and Ki-67 in the carcinoma of larynx and hypopharynx to determine the relationship with the various clinicopathological parameters.
MATERIALS AND METHODS:
Paraffin embedded tissue specimens from 40 cases of squamous cell carcinoma of the larynx and hypopharynx were studied by immunohistochemical method using the Ki-67 and cyclin D1 antibody. K1-67 index and expression of cyclin D1 were compared with the recurrence, survival rate, disease free time and other clinicopathological parameters such as, primary site, pathologic differentiation, tumor stage and lymph node metastasis.
RESULTS:
The higher Ki-67 index was significantly correlated with poorer pathologic differentiation, and shorter disease free time. But there was no significant correlation between over expression of cyclin D1 and any factor for the head and neck cancer. However, the expression of cyclin D1 had a significant positive relationship with Ki-67 index (p<0.05).
CONCLUSION:
Ki-67 index is a good prognostic factors and cyclin D1 may be important in tumorigenesis for squamous cell cancer of the larynx and hypopharynx. |
| Keywords:
Ki-67ㆍcyclin D1 |
서론
전체암의 3∼5%를 차지하는 두경부 편평세포암종의 치료는 수술적 치료, 항암화학요법, 방사선치료 등을 단독 혹은 병합하고 있는데 50% 내외의 치료율을 보여 다른 부위의 종양보다 비교적 좋은 예후를 보인다.1) 현재까지의 치료방침은 환자요인과 원발병소의 병기 및 경부 림프절 전이의 유무 등의 종양요인에 의하여 결정되고 있는데 임상적 병기 및 조직병리학적 분화도 등의 기존의 예후 인자로는 치료방침을 결정하는데 충분하지 않으므로2) 이를 보완할 수 있는 종양의 생물학적 성상을 반영하는 예후인자가 필요하다. 두경부 편평세포종암은 다른 종양과 마찬가지로 세포주기 조절의 이상을 초래하는 유전자 변이에 의하여 발생할 수 있고 이러한 유전자 변이는 성장 인자에 대한 반응을 매개하는 암 유전자, cyclin, cyclin-dependent kinase, cyclin-kinase inhibitor 등의 세포주기를 매개하는 유전자, 스트레스나 손상반응을 매개하는 p53 유전자 등으로 분류할 수 있다.3) 그 중 세포의 증식속도를 반영하는 인자로 Ki-67과 세포주기 조절에 관여하는 cyclin D1이 여러 종류의 암종에서 예후를 판정하는 표지자로 이용할 수 있는가에 대하여 연구되어 있으나4-6) 아직 두경부 편평세포암종에서는 그 연구가 미흡한 실정이다.
본 연구에서 저자들은 후두와 하인두 편평세포암종에서 Ki-67과 cyclin D1 단백질에 대한 항체로 면역조직화학 염색을 시행하여 두경부 편평세포암종에서의 Ki-67의 표지지수와 cyclin D1의 발현양상을 임상병기, 조직병리학적 인자 및 추적된 생존율과 비교분석함으로써 두경부암에서의 Ki-67과 cyclin D1의 예후적 의미를 평가하고 알려진 다른 임상병리학적 예후인자들과의 상관관계를 조사하여 두경부암의 생물학적 성상의 이해에 도움을 줄 수 있는지 알아보고자 하였다.
대상 및 방법
대상
1988년부터 1994년까지 6년간 한림대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학 교실에서 후두 및 하인두 편평세포암종으로 진단받고 수술과 방사선 치료를 시행한 환자중 40례를 대상으로 환자들의 병력지와 병리보고서를 토대로 성별, 연령, 미국 암학회 분류(American Joint Commitee on Cancer, 1997)에 따른 원발종양의 병기(T stage), 경부전이의 병기(N stage), 조직병리학적 분화도, 재발여부, 무병기간(disease free time), 생존기간 등을 후향적으로 분석하였다. 성별은 남자가 29명, 여자가 11명, 연령은 32세부터 76세까지로 60세 미만이 20명, 60세 이상이 20명이었고 평균연령은 57.6세이었다. 원발병소로는 후두암이 30례, 하인두암이 10례였고, T 병기는 1기 4례, 2기 9례, 3기 17례, 4기 10례이었고, 조직병리학적으로 림프절 전이가 없었던 군 21례, 있었던 군 19례, 조직병리학적 분화도는 고분화군 24 례, 중분화군 13례, 저분화군 3례이었고, 평균추적관찰기간은 45.7개월이었다.
연구재료는 수술시 적출된 종양을 포르말린 고정과 파라핀 포매를 거친후 헤마톡실린-에오신(hematoxylineosin) 염색을 시행하여 광학현미경하에서 조직학적 유형과 등급을 정한 다음 보관상태가 양호한 조직을 3 μm의 연속절편으로 만들어 사용하였다.
면역조직화학적 염색
Silane으로 처리한 슬라이드에 부착된 조직을 xylene에 5분간 3회 처리하여 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 70% ethanol, 증류수의 순서로 처리하여 함수시킨 후 실온에서 건조시켰다. 내인성 과산화 효소의 활동을 억제하고 일차 항체의 비특이적 결합을 감소시키기 위하여 3% H2O2가 포함된 methanol 용액에 10분간 처리하고 pH 6.0, 10 mM citrate 용액에 담근 후 microwave oven에서 121℃로 10분간 가열 후 DAKO LSAB(r)2 Kit(labelled streptoavidin-biotin)을 이용하여 면역조직화학염색을 시행하였다. 항체는 Ki-67(rabbit polyclonal, code No. A0047, DAKO, USA)은 5% 소혈청 알부민을 함유한 희석액을 이용하여 1：50으로 희석하여 상온에서 2시간, cyclin D1(DCS-6, mouse monoclonal, DAKO, USA)은 1：40으로 희석하여 4℃에서 16시간동안 각각 반응시켰다. Biotin이 부착된 anti-rabbit 및 anti-mouse 항체를 각각 30분간 반응시키고 tris 완충액으로 세척한 후 발색제인 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)를 이용하여 10분간 반응시킨 다음 세척하여 Mayer's hematoxylin으로 대조염색 후 봉입하였다. 음성대조군으로는 일차항체 대신 tris 완충액을, 양성대조군으로는 Ki-67은 편도의 germinal center, cyclin D1은 유방의 악성종양조직을 이용하였다.
판정 및 통계분석
판정은 종양의 중심부에서 비교적 세포의 밀도가 높은 부위를 임의로 3∼5곳을 선정하여 400배 시야에서 1000개의 종양세포당 핵내에 명확한 적갈색의 과립이 관찰되는 세포의 수를 세어 백분율을 구하여 Ki-67 표지지수를 구하고, cyclin D1은 같은 방법으로 핵내에 염색된 세포가 전체 종양세포의 10%이상 염색된 것을 양성으로 판정하였다. 통계처리는 윈도우형 SPSS 통계 프로그램을 사용하였으며 Ki-67 표지지수는 평균을 기준으로 평균이상의 군과 이하인 군으로 나누어 비교하였으며 이들의 발현 양상과 임상병리학적 인자들과의 관계는 Chi-square와 Fisher's extract 검정으로 분석하였고 Kaplan-Meier 법을 이용하여 생존 곡선을 그리고 각 집단간의 차이는 log-rank법을, Ki-67 표지지수와 cyclin D1 단백질 발현의 상관관계는 Spearman 상관분석을 이용하여 검정하였고 유의수준은 p<0.05를 의의 있는 것으로 하였다.
결과
Ki-67 과 Cyclin D1 모두 종양세포의 핵내에 적갈색 과립으로 염색되었다(Figs. 1 and 2). 전체 종양내 Ki-67 표지지수는 염색이 전혀 관찰되지 않은 2례를 제외하고는 3∼90%까지의 넓은 분포를 보였으며 평균은 23.9±19.0%, 중앙값은 20.0%로 이 중앙값을 기준으로 Ki-67 표지지수를 높은 군과 낮은 군으로 분류하여 임상인자들과 비교하였고, cyclin D1은 핵내의 적갈색 과립이 전체 40례중 15례(37.3%)에서 10%이상의 양성반응을 보였다.
연령 및 원발병소에 따른 Ki-67 표지지수와 cyclin D1 발현
연령별 분포에 따른 Ki-67 표지지수는 60세 미만군(19.9±17.3%) 보다 60세 이상인 군(27.9±20.3%)에서 높았으나 통계학적으로 유의한 차이는 없었다. Cyclin D1 단백의 발현율도 연령별 분포에 따른 유의한 차이는 없었다. 원발병소에 따른 Ki-67 표지지수는 차이가 없었다. Cyclin D1은 후두암에서 30례중 3례(10%), 하인두암에서 10례중 6례(60%)에서 양성을 보여 하인두암에서 양성율이 높았으나 현저한 개체수의 차이로 통계학적인 의의는 없었다(Table 1).
조직학적 분화도에 따른 Ki-67 표지지수와 cyclin D1 발현
Ki-67표지지수는 고도분화군이 17.5±13.2%, 중등도분화군이 32.3±27.0%, 저분화군이 38.3±11.5%로 분화도가 나쁠수록 Ki-67 표지지수가 증가하였고 통계적으로 유의하였다(p<0.05). Cyclin D1은 조직병리학적 분화도에 따라 각각 37.5%, 38.4%, 33.3%로 분화도에 따른 양성율의 차이는 없었다(Table 1).
병기 및 경부 림프절전이에따른 Ki-67 표지지수와 cyclin D1 발현
원발종양의 T병기에 따른 Ki-67 표지지수는 1기가 20.0±8.64%, 2기가 28.1±21.3%, 3기가 23.1±22.1%, 4기가 23.9±19.0%로 T병기와 Ki-67 표지지수는 연관성이 없었으며, Cyclin D1도 T병기에 따라 각각 25%, 55.5%, 41.1%, 20%로 연관성이 없었다(Table 1).
경부 림프절전이에 따른 Ki-67 표지지수는 조직병리학적으로 림프절 전이가 없었던 군은 20.6±18.9, 림프절 전이가 있었던 군에서는 27.5±18.9로 전이가 있었던 군에서 높았으나 통계학적 유의성은 없었다. Cyclin D1 단백질의 발현도 림프절 전이가 없었던 군에서 21례중 28.6%, 있었던 군에서 19례중 47.3%로 전이가 있었던 군에서 높았으나 통계학적으로 유의한 차이는 없었다(Table 1).
재발, 무병기간, 생존율에 따른 Ki-67 표지지수와 cyclin D1 발현
총40례 중에서 모든 치료 종료후 21례에서 재발을 보였으며 이중 원발부위 재발이 10례로 가장 많았고, 경부재발이 5례, 원발 및 경부재발이 1례, 원격전이가 5례(폐전이 4례, 골부 및 폐로 전이 1례)였는데 재발 또는 원격전이가 없었던 군과 있었던 군간의 Ki-67 표지지수와 Cyclin D1 단백의 발현은 모두 연관성이 없었다(Table 1).
평균 무병기간(mean disease-free time)은 37.2개월, 평균 생존기간(mean survival time)은 45.7개월, 5년 생존율은 40.19%이었고, 치료결과로는 치료종결후 연구시작까지 추적관찰한 결과 무병생존 17례, 다른질병으로 사망한 경우가 2례, 본 질병으로 사망한 경우가 21례이었다.
무병기간은 Ki-67지수가 낮은 군(Ki-67<20%)에서는 평균 37.9개월, 높은 군(Ki-67≥20%)에서는 평균 19.4개월로 Ki-67지수가 높은 군에서 통계적으로 유의하게 무병기간이 짧았고(p＝0.05), cyclin D1 음성군의 평균 30.4개월에 비하여 양성군에서는 평균 24.5개월로 재발까지의 기간이 빨랐으나 통계적 유의성은 없었다(Figs. 3 and 5).
5년 생존율은 Ki-67 표지지수가 낮은 군에서 42.2%, 높은군에서 38.4%로 지수가 높은 군에서 생존율이 낮았으나 통계적 유의성은 없었다(p＝0.16). Cyclin D1은 음성군에서 43.4%, 양성군에서 36.5%로 양성군에서 생존율이 낮았으나 통계적 유의성은 없었다(Table 2, Figs. 4 and 6).
Ki-67 표지지수와 cyclin D1 단백질 발현의 상관관계
Cyclin D1 음성군의 Ki-67 표지지수는 17.6±13.2%, 양성군의 Ki-67 표지지수는 34.3±22.8%, Spearman 상관계수 0.323(p＝0.042)로 Cyclin D1 양성군에서 Ki-67 표지지수가 의미있게 증가하였다(Table 3).
고찰
핵단백의 합성이 세포주기안에서 분명히 구분되는 간격을 갖는다는 cell kinetics에 관한 개념이 도입된 이래로 세포주기를 반영하는 여러 인자들에 대한 연구가 있었다. 조직에서 세포주기중 DNA 합성기인 S-phase를 관찰하는 방법은 호기성 염색방법과 thymidine labelling 방법, 유세포 측정기에 의한 DNA 분석방법, 그리고 bromodeoxy uridine(Brdu) incorporation7)과 Ki-67항체를 이용한 면역조직화학적 방법 등 여러 가지가 있다.8) Thymidine labelling과 Brdu incorporation 방법은 신선한 조직을 이용해야 하고 특히 thymidine labelling의 경우 방사능에 노출될 위험성이 있는 반면에 면역조직화학적 방법에 의해 세포의 주기를 측정하는 방법은 세포와 조직구조가 유지되고 간단하고 빠른 결과를 볼 수 있어 많이 사용되고 있다. 이러한 세포주기를 관찰하는 연구가 과거 신선한 조직을 이용한 동결절편에서만 이루어져 많은 양의 종양조직과 많은 시간을 필요하였으나 최근의 분자생물학적 기법의 발달로 파라핀 포매조직에서도 염색이 가능하게 되면서 종양세포의 증식능이 간편하고 신속하게 객관적 측정이 가능하게 되었다. 최근의 이러한 세포의 증식능을 측정하는 지표로서 Ki-67, PCNA(proliferating cell nuclear antigen), anti-ribonucleotide reductase, anti-DNA polymerase alpha 등이 이용되고 있다.
이 중 Ki-67은 Gerdes와 Li 등9)이 면역조직화학적 염색법으로 Ki-67이 G0기와 초기 G1기를 제외한 모든 세포주기에서 발현된다고 보고한 이래 여러 종양세포에서 면역화학염색법을 이용하여 세포의 증식을 나타내는 표지지수로 연구되었다. Geldes 등10)은 Ki-67항원을 종양조직에서 뿐만이 아니고 림프절의 배중심(germinal center), 표피 배중심(epidermal germinal center), 장음와 세포(intestinal crypt cells), 미분화된 정조세포(undifferentiated spermatogonia), 흉선, 편도 등 증식기에 있는 정상조직에서도 관찰하였다. Gasparini 등5)은 Ki-67 이 유방암에서 병리학적 분화도와 생존율에 따라 유의하게 증가되었다고 보고하였고, Hopf 등4)은 뇌종양에서 Ki-67 표지지수가 높아짐에 따라 조직학적 분화도가 낮아지고 사망율이 증가한다고 하였으며 Porschen 등6)은 대장직장암에서 종양의 부피, 성별, 나이, 병리학적 분화도 및 종양의 병기와 무관하지만 재발한 예에서는 높은 Ki-67 표지지수를 보였다고 하였다. 본 연구에서는 조직병리학적 분화도가 좋지 않을수록 Ki-67 표지지수가 높게 관찰되어 세포의 증식이 활발하게 일어남을 알 수 있었고 또한 무병기간과 유의한 차이가 있음을 보여 Ki-67 표지지수가 높을수록 종양이 조기에 재발함이 관찰되었다. 하지만 본 연구에서 분석되었던 임상 인자들 중 원발 부위 및 종양과 경부림프절의 병기, 생존율과의 차이는 발견할 수 없었고 재발과는 역의 상관을 보였는데 이는 조직의 보관상태, 보관기간이 길어짐에 따른 조직항원성의 저하에 기인한 것으로 생각되며 그러나 조직병리학적 분화도, 무병기간에 따라서는 Ki-67 표지지수가 유의한 차이를 보여 종양세포의 병리학적인 인자들이 반드시 임상적인 인자들과 연관되지 않으나 예후를 추측하는데 도움을 줄 수 있으리라 생각된다.
Cyclin D1은 염색체 11q13에 위치하는 유전자로 cyclin dependent kinase 4 혹은 cyclin dependent kinase 6과 복합체를 형성한다. Rb(retinoblastoma)단백의 인산화를 시켜 Rb의 G1 세포주기억제기능이 불활성화되어 S기로의 전환을 촉진하여 암의 발생을 유도한다.11) 두경부, 폐 및 식도의 편평세포암종 등 여러 암종에서 10∼50%에서 cyclin D1 유전자의 증폭이 있으며, 임상예후와의 관련성에 대한 보고가 있었다.3)12)13) 두경부 편평세포암종에서 cyclin D1 유전자 과발현에 대한 임상적 의미는 아직 명확히 규명되어 있지는 않으나 cyclin D1 유전자의 증폭과 단백의 과발현을 보고하여 단백의 과발현과 임상병기와의 유의한 관계를 보고하였다.14) 폐암에서의 연구를 살펴보면 염색체 11q13의 증폭이 있으면 병기가 진행하였거나 저분화도를 갖는다고 하였으며,15) 두경부암의 면역조직화학적 연구에서는 47례중 30례(64%)에서 cyclin D1의 과발현이 관찰되어 낮은 생존율과 연관이 있다고 하였다.3) 그러나 Leonard 등16)은 두경부 편평세포암종에서 증폭과 생존율과는 관계가 없다고 하였고 Davidson 등17)도 cyclin D1의 증폭이 22%에서 관찰되었으나 임상병기나 병리학적 인자와는 연관이 없다고 하였다. 이 연구에서는 40례중 15례에서 cyclin D1 단백 발현이 37.3%에서 양성을 보였으나 이와 원발병소, 원발종양의 병기, 림프절 전이여부, 병리학적 분화도, 무병기간, 생존율과의 상관관계는 없었다. 이는 cyclin D1 유전자의 증폭이외에도 촉진자(promotor) 부위에서의 돌연변이, 조절인자의 변형, 유전자 전위(translocation), 역위(inversion)등에 의하여 단백질 과발현이 발생할 수 있기 때문으로 생각된다.18) 그러나 이 연구에서 cyclin D1 양성인 군에서 높은 Ki-67 표지지수를 보여 cyclin D1 단백의 과발현이 높은 세포증식을 유발함으로써 종양 생성에 관여한다고 생각된다.
결론
Ki-67 표지지수는 암의 병리학적 분화도에 따라 유의하게 증가함이 관찰되었고, Ki-67 지수가 높은 군에서 조기재발을 보였고 cylin D1 양성인 군에서 높은 Ki-67지수를 보여 예후를 반영하는 인자로 의미가 있었으나 원발부위, 림프절 전이나 종양의 재발여부, 생존율과는 상관관계가 없었으며 cyclin D1 단백의 과발현은 원발종양의 병기, 림프절전이, 병리학적 분화도, 무병기간, 생존율과의 상관관계가 없었다.
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