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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(5): 614-619. |
| Expression of p53, mdm-2, nm23 and TGFalpha in Primary and Second Primary Cancers in Multiple Head and Neck Cancers. |
| Geon Choi, Jong Seok Song, Dong Hee Yoo, Sung Won Chae, Kwang Yoon Jung, Jong Ouck Choi, Ae Ree Kim |
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. entkms@cmc.cuk.ac.kr
2Department of Pathology, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. |
| 두경부에 발생한 다발암에서 일차암과 이차암의 p53, mdm-2, nm23, TGFα의 발현양상 |
| 최건1 · 송종석1 · 유동희1 · 채성원1 · 정광윤1 · 최종욱1 · 김애리2 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실1;병리학교실2; |
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| 주제어:
두경부암ㆍ다발암ㆍ영역암발생ㆍ공동클론기원. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Development of second primary cancer is an important biological characteristic of head and neck squmaous cell carcinoma. In the past, the development of second primary cancer has been explained by the field cancerization theory. However, recent reports support the common common clonal origin theory. Common clonal origin theory states that following the initial transformation, the progeny of the transformed clone spread through the mucosa and gives rise to the geographically distinct but genetically related tumor. The objective of this study is to compare the expression pattern of p53, mdm-2, nm23 and TGFalpha which are proteins involved in the development, growth and metastasis of tumor in primary and second primary cancers of multiple head and neck cancer.
MATERIALS AND METHODS:
Expression of p53, mdm-2, nm23 and TGFalpha were analysed by immunohistochemical study of 12 paraffin embedded sections from 6 patients (3 synchronous tumors, 3 metachronous tumors) who were surgically treated for multiple head and neck cancer.
RESULTS:
p53, mdm-2, nm23 and TGFalpha were expressed in the same pattern in 3 patients (50%) of primary and second primary cancers.
CONCLUSION:
In our study, we observed the same expression patterns in 3 cases; however, it was difficult to conclude based on this result alone the clonality relationship between primary and second primary cancer. We suggest that further studies using molecular biological techniques are needed to identify the early genetic events of carcinogenesis. |
| Keywords:
Multiple head and neck cancersㆍCommon clonal originㆍp53ㆍmdm2ㆍnm23ㆍTGFalpha |
서론
두경부암의 생물학적 특성의 하나는 다발암이 흔히 발생하는 것으로, 진단 기술과 치료 방법의 발달로 인한 두경부암 환자의 생존율이 높아짐에 따라 이차암의 발생률이 점차 증가하고 있으며 두경부암 환자에서 이차암이 발생할 가능성은 매년 3∼7%이다.1)
이차암은 임상적으로 일차암과 동시에 발견되는 동시기암(synchronous)과 일정 기간 후에 발생하는 이시기암(metachronous)으로 나뉠 수 있는데 과거에는 암 유발물질에 지속적인 노출로 인한 상부 기식도관(upper aerodigestive tract)의 여러 점막에서 세포의 암화가 독립적으로 발생한다는 field cancerization의 개념으로 이차암의 발생기전을 설명해 왔고, 많은 연구들이 이를 뒷받침하고 있다.2-5) 그러나 최근에 세포의 변형이 있은 후 변형된 클론이 점막하를 통해 퍼져 원발 종양에서 떨어져 있는 부위에서 동일한 클론의 이차암이 성장한다는 공통 클론 기원(common clonal origin)에 대한 연구 결과6-8)가 있어 일차암과 이차암이 공통 클론인지 다른 클론인지에 대해서 논란이 되고 있다.
본 연구는 일차암과 이차암의 클론성에 도움을 얻고자 일차암과 이차암에서 면역조직화학 염색을 이용하여 종양의 발생과 성장 및 전이와 관련 있는 단백인 p53, murine double-minute(mdm-2), nm23, transforming growth factor(TGFα)들의 발현 양상을 비교하고자 하였다.
재료 및 방법
연구대상 및 재료
두경부 다발암으로 진단 받고 수술적 치료를 시행한 환자 중 파라핀 포매조직의 이용이 가능한 6명의 다발암 환자의 12조직을 대상으로 하였고 이들은 모두 편평상피세포암으로 확인되었고 환자의 특성은 Table 1에서 보는 바와 같다. 원발암과 동시에 혹은 6개월 이내에 이차암이 발생한 동시기암이 3례였고, 원발암이 발생하고 6개월 이후에 이차암이 발생한 이시기암이 3례였다.
면역조직화학 염색
수술시 적출된 조직은 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin) 염색 표본을 검토하여 종양의 중심부라고 판단되는 부위를 선택하였다. 각 종양의 파라핀 포매조직은 4 μm 두께의 절편으로 만들어 양전하를 띤 슬라이드(ProbeOn Plus Microscope Slides FisherBiotech , USA)에 부착시키고 60℃ 신전기로 건조시킨 후 xylene에 탈 파라핀 시키고 100%, 95%, 90%, 80% 알코올로 처리 후 증류수에 담가 함수 처리 하였다. 내인성 과산화효소를 억제시키고 일차 마우스 단클론 항체의 비특이적 결합을 감소시키기 위해 메탄올-과산화수소 용액에 10분간 처치한 다음 pH 7.6의 tris완충액을 3분간 수세하였다. p53과 mdm2염색을 시행할 슬라이드는 pH 6.0 citric acid용액에 잠기게 한 후 microwave oven에서 121℃로 15분간 가열한 다음 15분정도 상온에서 식히고 tris 완충액에서 중화시킨 후 정상 혈청을 가하고 실온에서 15분간 방치하였다. 일차 항체를 도포하여 37℃에서 2시간동안 반응시킨 다음, tris 완충액에서 5분간 2회 수세하였다. 수세된 시료에 biotinylated secondary antibody(Histostatin TM SP kit, Zymed Lab. Inc.)를 가한후 20분간 실온에서 반응시키고 재차 수세하여 streptoavidin-peroxidase(Histostatin TM SP kit, Zymed Lab. Inc.)를 가해 15분간 반응시킨 다음 tris 완충액에서 수세하였다. p53, TGFα는 AEC(Zymed lab. Inc., USA)로 mdm2, nm23는 diaminobenzidine으로 발색시킨 다음 헤마톡실린으로 대조 염색하고 봉입하였다.
양성 대조군은 각 유전자 산물에 양성으로 확인된 유방암과 위암조직을 사용하였으며 음성 대조군은 각 조직에서 일차 항체를 처리하지 않고 항체 희석에 사용되었던 tris 완충액으로 대치하여 같은 절차로 염색하였다.
각 유전자 산물에 대한 일차 항체로는 단클론성 항체를 사용하였다. p53에 대한 일차 항체로는 anti-human p53 protein(Clone DO-7, Novocastra, Newcastle, England)을 1：100으로 희석하여 사용하였고, mdm2에 대해서는 NCL-mdm2(Novocastra, Newcastle, England)를 1：10으로, nm23에 대해서는 nm23-H1/NDPK-A protein(Novocastra, Newcastle, England)을 1：100으로, TGFα에 대해서는 TGFα Ab-2(Clone 213-4.4, Oncogene Science, Massachusetts, USA)를 1：20으로 희석하여 사용하였다.
결과 판정
광학현미경 400배 시야에서 각 슬라이드 중 염색성이 가장 진한 부위를 선택하였으며 전체 핵에서 p53은 붉게, mdm2는 진한 갈색으로 염색된 세포를 양성으로 판정하였다. 구성세포의 세포질에 nm23은 진한 갈색으로, TGFα는 붉은 과립성 반응이 있을 때 양성으로 판독하였으며 염색상이 전혀 없거나 주변의 비특이적 반응과 차이가 나지 않으면 음성으로 판독하였다. 이들은 다시 전혀 염색되지 않은 경우를 -, 5% 이하의 세포에서 염색상을 보일 경우를 ＋, 5%에서 25%의 양성반응을 보일 경우를 ＋＋, 25%에서 50%의 양성 반응을 보일 경우를 ＋＋＋, 50% 이상의 경우를 ＋＋＋＋로 하여 측정하였다.
결 과
p53 단백의 발현은 조직에 따라 종양세포의 핵에 다양하게 붉은 색으로 염색되었다(Fig. 1). 총 12조직 중 6조직(50%)에서 양성 반응을 보였고 일차암과 이차암 모두에서 발현된 예가 2례(33.3%), 모두 음성인 예가 2례(33.3%), 일차암에서만 발현된 예가 1례(16.6%), 이차암에서만 발현된 예가 1례(16.6%)였고 4례(환자 1, 2, 3, 4)에서 유사한 형태의 발현 양상을 보였지만 이 중 환자 3은 일차암에서는 ＋＋＋, 이차암에서는 ＋＋＋＋로 염색된 세포의 수에서 차이를 보였다(Table 2).
mdm2단백의 발현은 핵에 진한 갈색으로 염색되었고 정상인 근육이나 표피세포에서도 거의 모두 염색이 되었다(Fig. 2). 총 12조직 중 10조직(83.3%)에서 양성 반응을 보였고 4례(환자 1, 2, 4, 5)에서 같은 형태의 발현 양상을 보였다(Table 2).
nm23은 주로 종양세포의 세포질에 갈색으로 염색되었으며 전반적으로 종양조직에 골고루 염색되었으나 각 조직에 따라 염색강도의 차이를 보였다(Fig. 3). 총 12조직 중 10조직(83.3%)에서 양성 반응을 보였고 4례(환자 1, 2, 4, 5)에서 유사한 형태의 발현 양상을 보였지만 환자 2와 환자 5에서는 일차암과 이차암에서 염색된 세포 수의 차이를 보였으나 일차암과 이차암 모두 ＋＋＋ 이상이었다(Table 2).
TGFα 단백의 발현은 세포질에 국한되어 붉게 염색되었다(Fig. 4). 총 12조직 중 11조직(91.7%)에서 양성 반응을 보였으며 4례(환자 1, 2, 3, 4)에서 유사한 형태의 발현 양상을 보였지만 환자 3과 환자 4에서는 일차암과 이차암에서 염색된 세포 수의 차이를 보였으나 일차암과 이차암 모두 ＋＋＋ 이상이었다(Table 2).
4가지 단백에 대해서 일차암과 이차암이 유사한 발현 양상을 보인 예는 3례(환자1, 2, 4)였다.
고찰
두경부 다발암의 발생은 두가지로 설명할 수 있는데 하나는 다수의 세포 변이가 유전적으로 연관이 없는 다발암을 유발시킨다는 것이다. 1953년 Slaughter등2)은 구강암 환자의 11%에서 상부 기식도관의 다발암이 발생하였다고 하여 field cancerization의 개념을 처음 제시하였다. Chung등4)은 31명의 두경부 다발암 환자에서 p53 유전자의 DNA를 single strand conformation polymorphism(SSCP) 기법을 이용하여 p53 유전자 변이의 존재와 위치를 분석한 결과 유전자 변이가 있었던 21례 중 5례에서는 일차암과 이차암 모두에서 변이가 관찰되었으나 서로 다른 위치에서 변이가 확인되었고, 8례에서는 일차암에서만, 나머지 8례에서는 이차암에서만 변이가 확인됨으로써 이들은 독립적으로 발생하는 것이라 하여 field cancerization의 개념을 분자 생물학적 기법을 이용하여 처음으로 증명하였다.
다른 하나의 설명은 하나의 세포가 변형되어 점막을 통해 퍼져 유전적으로 연관이 있는 다발암을 유발한다는 것이다. 만약 다발암이 하나의 클론에서 기원한다면 세포의 형질변환이 있은 후 어느 시점에서 주위 정상 점막으로 옮겨가거나 타액에 묻혀서 작은 점막의 손상이 있는 부위에 파급될 수 있다. 어떤 형태로든 퍼져 나간 변형된 세포는 분화와 성장을 계속하면서 원래의 클론과는 다른 독립적인 새로운 유전자 변이를 축적하게 될 것이다.8) Sidransky등6)은 방광에 다발암이 발생한 4명의 여자 환자를 대상으로 X염색체 불활성화 형태(pattern of X-chromosome inactivation)를 분석한 결과 각각의 환자에서 모든 종양이 같은 형태를 가지고 있었고 염색체 9q에서 같은 대립 유전자의 손실(allelic loss)을 증명하여 방광내 다발암은 하나의 변형된 세포에서 기원한다고 하였고, Worsham등7)은 2명의 두경부 동시기암 환자에서 종양세포의 핵형 분석과 형광 인싸이투 보합결합법(fluorescence in situ hybridization)을 이용하여 일차암과 이차암은 공통 클론 기원임을 증명하였다. Bedi등8)은 두경부 다발암을 가진 8명의 여자 환자들을 대상으로 배형성기간(embryogenesis) 동안에 일어나는 X염색체의 불활성화 형태를 PCR-based androgen receptor assay를 이용하여 분석하였고 두경부 암화과정 중 초기 변화 중 하나인 염색체 9p21과 3p의 대립 유전자의 손실을 microsatellite analysis를 이용하여 조사하였다. 그 결과 분석이 가능했던 4례 중 모두에서 같은 형태의 X염색체 불활성화 형태를 보였고 9례 중 3례에서 같은 형태의 이종접합체 상실(loss of heterozygosity, LOH)을 나타냈다. 2례에서 염색체 9p에서 동일한 파단점(breakpoint)을 보였고 염색체 3p에서 동일한 microsatellite alteration이 있어 이들 종양은 같은 클론에서 기원함을 알 수 있어 두경부 다발암의 적어도 일부에서는 하나의 클론에서 기원한다고 주장하였다.
본 연구에서는 일차암과 이차암에서 면역조직화학 염색을 이용하여 종양과 관련있는 유전자 단백인 p53, mdm-2, nm23 및 TGFα의 발현 양상을 비교하였다. 상부 기식도관에서 암화과정(carcinogenesis)은 복잡한 다단계 과정을 거치며9) 암 유전자와 암억제 유전자의 변이가 암화과정에 필수적이고 특히 유전자 단계에서 가장 흔한 변이중의 하나가 지금까지는 p53유전자 변이로 알려져 있다. 10)11) 두경부 종양에서 p53 종양억제 유전자의 비정상적 발현과 유전자 변이는 많이 보고되고 있으나 암화 과정중 어느 단계에서 p53유전자 변이가 발생하는지에 대해서는 대부분이 종양 발생의 초기 단계에 이루어진다고 보고되고 있지만 확실치는 않다.5)12)13) p53유전자는 염색체 17p13.1에 위치하는 대표적인 암억제 유전자로서 세포주기 조절, 전사 조절(transcriptional regulation) 및 세포 분화(cell differentiation)의 조절을 통하여 정상적인 세포증식(cell proliferation)을 조절하는 기능을 갖고 있다.10) Gallo등 13)은 두경부에 발생한 일차암과 이차암, 그리고 종양이 침범하지 않은 정상조직에서 p53의 발현 양상을 면역조직화학 염색을 이용하여 비교하였다. 총 12환자 중 일차암과 이차암 모두에서 양성인 예가 5례(50%), 모두 음성인 예가 1례(8%), 일차암에서만 발현된 예가 3례(25%), 이차암에서만 발현된 예가 2례(17%)였다. Nees등5)은 종양과 떨어진 부위의 조직에서 p53유전자 변이가 있었던 15명의 두경부 암환자에서 추적관찰 중 5명이 이차암이나 재발암이 발생하였다고 보고하였다. 본 연구에서는 6례 중 4례에서 p53의 발현이 일차암과 이차암 모두 유사한 형태로 발현되어 Gallo등 13)의 연구와 부합되는 소견으로 생각된다. p53음성인 예에 대해서는 암이 p53유전자와 무관하게 진행되었을 경우와 p53유전자의 점변이의 산물이 불안정하여 면역조직화학적 방법으로는 확인할 수 없을 경우, 그리고 종양의 유전적 진화가 수많은 변이의 축적으로 이루어지고 이들 변이의 순서는 개개 종양마다 다를 수 있어 같은 클론에서 기원된 종양들이라도 유전적 변이가 독립적으로 일어날 수 있고 어느 시점에서 세포가 옮겨졌는지에 따라서 p53이 일차암이나 이차암에서, 혹은 모두에서 다르게 표현 되었을 경우로 해석할 수 있다.13)
전사를 조절하고 종양의 성장을 억제하는 p53의 기능은 mdm2유전자 단백이 p53의 전사활성영역(transcriptional activation domain)에 결합하여 은폐시킴으로써 p53의 기능을 방해하는 것으로 알려져 있다.14) 이러한 mdm2유전자는 염색체 12q14.3-q15에 위치하며 Rb유전자 산물과 결합하여 G1기에 세포정지(cell arrest)를 유도하는Rb유전자의 기능을 억제한다.15) 본 연구에서는 6례 중 4례에서 일차암과 이차암이 유사한 양상으로 발현되었으나 기존의 연구 중 일차암과 이차암에서 mdm2의 발현양상을 보고한 연구가 없어 본 연구와 비교를 하지 못하였다.
nm23은 전이능력이 약한 세포에서 nm23 mRNA의 표현이 강하다는 것이 알려진 이후로16) 현재까지 2종류의 murine type과 2종류의 human type이 밝혀졌다. human type nm23 유전자는 염색체 17q21에 위치하며 90% 정도의 유전자 순서의 동일성을 가지는 두가지 형태의 유전자(nm23 H1과 nm23 H2 유전자)로 존재하며 nm23 H1이 종양의 전이를 억제하는데 관여한다고 하지만17) 현재까지 암의 전이성 여부 및 예후 판정과 nm23의 발현 정도에는 논란이 있다. 본 연구에서는 6례 중 4례에서 일차암과 이차암이 유사한 양상으로 발현되었으나 문헌고찰에서 nm23의 발현을 다발암에서 시행한 보고는 없었다.
TGFα는 육종바이러스에 의하여 변형된 섬유모세포에서 처음으로 분리된 저분자량(6000MW)의 50개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드로서18) 세포의 종양성 전환에 관여하며 상피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)를 매개로 하여 tyrosine kinase 활성도를 증가시켜 세포 증식에 관한 신호 전달을 하는 성장인자로서 정상 세포가 악성으로 전환될 때 분비되며, 종양세포 자체에서도 생성, 분비되어 주위 종양세포들의 종양성 전환에 영향을 미치고 주위 종양세포들에는 성장을 자극하는 효과가 있을 것으로 추측되고 있다.19) 본 연구에서는 83.3%에서 양성 발현률을 보였고 6례 중 4례에서 유사한 발현양상을 보였으며 TGFα 역시 다발암에서 시행한 보고는 없었다.
본 연구에서는 면역조직화학염색 방법의 결과해석에 대한 한계가 있어 공통클론기원에 대한 확실한 결론을 내리기는 불충분하지만 적어도 일부 두경부편평세포암종 환자에서 다발암의 발생기전에 클론확산설의 관여를 시사하는 소견으로 생각된다.
결론
두경부 다발암에서 일차암과 이차암의 p53, mdm-2, nm23 및 TGFα 발현양상은 6례 중 3례에서 유사한 양상으로 나타났다. 그러나 적은 증례와 면역조직화학적 방법만으로는 일차암과 이차암의 클론성을 완전히 밝히기는 어려워, 향후 더 많은 증례와 분자생물학적 기법으로 종양으로의 변환과정 중 초기 유전자적 변화를 밝히는 연구가 필요할 것으로 생각되었다.
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