Address for correspondence : Il-Seok Park, MD, PhD, Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Ilsong Memorial Institute of Head and Neck Cancer, Hallym University College of Medicine, 94-196 Yeongdeungpo-dong, Yeongdeungpo-gu, Seoul 150-030, Korea
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서     론

   Epigenetics란 DNA 염기서열의 변화 없이 유전자 발현의 양상이 변하여 자손에게 유전되는 것을 말한다. 지금까지 두경부 암의 분자생물학적 연구는 주로 4가지 염기서열의 변화(소실, 치환, 증폭 등)에 의한 비정상적인 유전정보가 종양형성유전자나 종양억제유전자에 축적되어 그 기능이 증폭 혹은 소실되어 암 발생에 영향을 미친다는 개념의 연구가 주를 이루어 왔으나 이것만으로 암의 발생이나 성장, 전이 과정을 설명하기는 부족하였다. 최근 들어 돌연변이 없이 유전자의 발현양상만을 조절하는 epigenetics가 암 관련 연구의 새로운 분야로 발전해 나가고 있다.¹⁾
   Epigenetic 변화는 DNA 메틸화(methylation), 히스톤 변환(histone modification)과 genomic imprinting 등의 과정을 통해 일어나며 이를 응용하여 진단과 치료영역에서도 새로운 시도가 이루어지고 있다.^1,2)
   Epigenetics의 개념은 1983년 Feinberg와 Vogelstein³⁾에 의해 정상세포에 비해 종양세포의 genome 위에서 메틸화 상태가 유의하게 감소되어 있는 사실을 발견하면서 소개되었다. DNA 과메틸화(hypermethylation)에 의해 종양억제유전자의 발현이 억제될 수 있다는 것은 1989년 Creger 등⁴⁾이 RB promoter의 과메틸화를 보고하였고 1999년 Toyota와 Issa⁵⁾는 각종 장기의 종양에서 DNA promoter 과메틸화 현상을 정리하여 CpG island methylator phenotype라는 이론을 정립하였다.

본     론

Epigenetics의 기전

DNA 메틸화
   DNA 메틸화는 DNA methyl transferase(DNMT)에 의해 CpG의 5' 탄소 부위에 메틸기(CH3)가 결합된 것이다. CpG dinucleotides가 여러 개 모여있는 CpG islands는 주로 promoter나 근처에 또는 exon의 시작 부위에 위치하는데 CpG islands에 메틸기(methyl)가 결합하면, mRNA 전사가 방해를 받아서 유전자 발현이 억제된다(Fig. 1). Cytosine은 guanosine의 5' 위치에 있을 때에만 메틸기가 결합할 수 있다. 그러므로 그냥 cytosine 메틸화라기보다는 G와의 관계를 함께 나타내서 CpG 메틸화라는 용어를 주로 사용하게 된다. 그런데 CG라 쓰지 않고 CpG라고 쓰는 이유는 DNA 이중나선에서 한쪽의 DNA 가닥에 있는 C에 대하여 반대쪽 DNA 가닥에 수소 결합으로 대응하여 한 쌍을 이루게 되는 염기는 G인데 이를 흔히 C：G로 표현한다. 따라서 이러한 염기쌍 C：G와 구분하는 의미와 함께, 하나의 DNA 가닥에 나란히 5'→ 3' 방향으로 연이어서 위치하는 두 핵산을 phosphate를 매개로 결합되어 있다고 하여 CpG라고 한다.⁶⁾ 이렇게 메틸화된 세포가 증식 과정에서 DNA를 복제할 때, DNA methyl transferase 1(DNMT1)은 DNA 주형의 CpG 핵산에 결합되어 있는 메틸기를 인지하고, 새로 합성되는 DNA 가닥 내의 CpG 핵산에도 메틸기를 더해 주게 된다. 이러한 방식으로 메틸화 상태는 자손세포에게 전달될 수 있다. 결국 메틸화에 의해 특정 유전자의 발현이 억제되는 양상이 염기서열의 변화 없이 메틸화 상태의 전달만으로 자손 세대에 유전되는 것이다.^{6,7,8,9,10,11,12,13)}
   DNA 메틸화는 정상세포에서는 세포 발달과 분화, 성장에 작용을 하고,¹⁴⁾ 암 발생과 관련해서는 종양억제유전자나 다른 암 관련 유전자의 promoter 부위에 과메틸화(hypermethylation)가 일어나 해당 유전자 발현을 억제한다. 더불어 정상에서는 억제되어 있는 종양유발유전자들의 탈메틸화 또는 저메틸화(demethylation or hypomethylation)를 통해 암 유발에 관여한다.¹⁵⁾

Histone modification
   DNA는 단독으로 존재하지 않고 히스톤(histone)이라는 단백과 결합하여 크로마틴(chromatin)이라는 복합체로 존재한다. 크로마틴의 구조적 변화가 유전자 발현에 중요한 영향을 미치는데 크로마틴이 치밀구조(tight-knit)를 이루면 DNA에 접근이 어려워 결과적으로 유전자의 발현을 저해하고, 크로마틴이 화학적 변화에 의해 좀 더 열린 구조를 가지게 되면 유전자를 발현하게 된다(Fig. 2).

Genomic imprinting
   Imprinting은 한쪽 어버이(allele)의 대립형질에만 일어나는 epigenetic 변화로 imprinting의 소실(loss of imprinting, LOI)은 종양관련 유전자와 연관되어 암을 일으키는 소인으로 작용한다. 최근 대장암에서 human insulin like growth factor II 유전자의 LOI가 높게 나타나는 것이 보고되었고,¹⁶⁾ 이러한 연구는 흡연과 과도한 음주와 연관없는 젊은 층에서 환경적 발암위험인자와 무관하게 발생하는 구강이나 구인두 암의 발병기전을 뒷받침하고 있다.

암 Epigenetics를 위한 분자생물학적 검사법
   임상 검체에서 크로마틴의 변화는 확인하기가 어려운 반면 DNA 메틸화 관련 유전자들은 보존이 용이하여 암 관련 epigenetics는 주로 종양관련 유전자의 메틸화에 대한 연구가 주를 이루고 있다.

Polymerase chain reaction(PCR)을 이용한 단일유전자 DNA 메틸화의 검출법
   첫 번째는 PCR을 이용한 bisulfite DNA 변환을 통해 비메틸화 DNA의 cytosine은 uracil로 변환되고 메틸화된 DNA는 cytosine으로 보존되는데 PCR 증폭 후 uracil은 thymidine으로 변환되어 염기서열의 C와 T의 차이를 이용하여 검출하는 방법이다.^17,18) 두 번째는 변형된 bisulfite 변환과 제한효소분석을 이용한 Combined Bisulfite Restriction Analysis(COBRA)라는 방법이며¹⁹⁾ 세 번째는 methylation specific PCR(MSP)로 특정화된 메틸화 또는 비메틸화 primer를 이용하여 메틸화 여부를 확인하는 방법이다.²⁰⁾
   이와 비슷하게 primer를 이용하여 좀 더 민감하고 효율적인 정량적 메틸화 분석으로 "MethyLight"라는 형광 실시간 PCR 방법이 있다.²¹⁾ 넷째는 최근 들어 변형된 bisulfite DNA 메틸화 mapping 기술로 "pyrosequencing"²²⁾과 "RNase T1 cleavage/matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight(MALDI-TOF)" 방법이 있다.²³⁾

Genome-wide epigenomic 검출법
   유전자의 발현 유무는 단일위치의 메틸화로 알 수 있지만 종양의 발생과정은 global DNA 메틸화의 변화와 관계되어 있다. 크게 non-array 방법과 array 방법으로 나눌 수 있으며 non-array 방법에는 빠르게 전체적인 유전자의 메틸화 상태를 알아볼 수 있는 High Performance Liquid Chromatography(HPLC), NotL 등의 메틸화 민감 효소를 사용하여 종양과 비종양 부위의 차이를 비교하는 restriction landmark genomic scanning(RLGS)²⁴⁾ 방법과 subtraction PCR 방법과 유사한 methylation sensitive representational difference analysis(MS-RDA) 등이 있다.²⁵⁾ Microarray를 이용한 방법은 암 메틸화 여부를 검사하는 differential methylation hybridization(DMH),²⁶⁾ 유전자 전사를 측정하는 expressed CpG island sequence tag(ECIST)²⁷⁾와 크로마틴의 구조변화를 검사하는 ChIP-on-chip²⁸⁾ 등이 있다.

Epigenetics의 임상적용

진  단
   특정 암세포의 비정상적인 DNA 메틸화를 이용하여 조직샘플이나 혈청의 free DNA로부터 암세포 확인하는 방법과 질병의 phenotype과 연관된 DNA 메틸화를 이용하여 진단하는데 이는 예후, 항암치료에 대한 치료효과나 부작용 등을 알아보는 표지자로 이용하며 조직에서 암의 발생 위험도를 알아보는 표지자로도 사용된다.
   비정상적인 DNA 메틸화를 표지자로 쓰는 경우가 유전자 돌연변이를 표지자로 쓰는 경우보다 민감도가 높으며 방법이 간단하며 초기 암이나 정상조직에서도 관찰이 가능하다는 장점을 가지고 있다. 타액, 소변이나 객담 등의 체액에서 암세포의 검출은 높은 민감도가 필수적인데 타액에서 p16, death-associated protein kinase(DAPK)와 06-methylguanine DNA methyl transferase(MGMT)의 메틸화 분석이 두경부 암의 진단에 쓰이고 있다.²⁹⁾ 또 혈청이나 혈장에서 methylation specific PCR(MSP)나 정량적 MSP를 이용하여 DNA로부터 p15, p16, DAPK, MGMT, E-cadherin과 RASSFIA의 메틸화 여부를 확인한다.³⁰⁾

치  료
   Epigenetic 정보는 유전이 되지만 가역적이어서 여러 가지 약제를 통해 epigenetic 정보를 변형시켜 암치료에 응용하려는 연구가 진행 중이다.

5-Aza-2'-Deoxycytidine, Zebularine and Others
   DNA methyl transferases(DNMTs), 특히 DNMT1은 CpG의 메틸화를 유지하는 데 중요한 역할을 한다. DNMT1 억제제인 5-Aza-2'-Deoxycytidine(5-aza-dC, decitabine)은 DNMT1의 분해를 유도하여 저메틸화(hypomethylation)를 일으킨다(Fig. 3).
   1990년대에는 고용량의 5-aza-dC를 세포독성 항암약물로 사용하였으나 2000년대에 들어서면서 탈메틸화 작용기전이 밝혀져 저용량으로 백혈병 같은 혈액관련 질환에 효과적인 치료제로 쓰이기 시작했다.³¹⁾ 주요 부작용은 골수 억제작용이며 저용량 사용으로 치료 순응도는 높지만 지속시간이 짧은 단점을 보완하여 zebuarine이 개발되었다(Fig. 3).³²⁾ 이미 임상에서 상용되고 있는 procainamide, procaine과 (-)-epigallocatechin-3-gallate(EGCG) 같은 약물이나 음식도 탈메틸화 작용을 보인다.³³⁾ Phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotide인 MG98은 DNA methyltransferase mRNA의 특이적인 억제제로 임상실험 중이다.³⁴⁾

Histone deacetylase(HDAC) inhibitors
   Histone 변형은 DNA 메틸화와 밀접한 관계가 있고 유전자 조절에 중요한 역할을 한다. 히스톤 아세틸화와 히스톤 H3 Lys4의 메틸화는 능동적 유전자 전사와 연관이 있으며 히스톤 H3 Lys9는 유전자 억제와 연관이 있다.  
   HDACs에 의해서 매개되어지는 히스톤 탈아세틸화는 치료목적으로 연구되어지고 있으며³⁵⁾ HDACs 억제제는 히스톤의 과아세틸화와 p21 WAF1 같은 세포주기 억제제를 상승시켜 세포주기 진행억제, apoptosis를 유도한다(Fig. 4).³⁵⁾ DNMTs 억제제와 HDACs 억제제를 병용하였을 경우 좀 더 효과적인 치료결과를 얻을 수 있는데,³⁵⁾ 메틸화된 종양억제유전자를 활성화시켜 종양세포의 세포주기 진행을 억제하고 세포 분화와 apoptosis를 유도한다.³⁶⁾ 또 Micro RNAs를 상승시켜 apoptosis를 억제하는 종양유발유전자들을 감소시키고 종양특이항원의 발현을 높여 면역치료의 효과를 높여준다. 다른 한편으로는 선행항암화학요법 후 병용치료를 시행함으로써 암 줄기세포의 분화를 유도한다(Fig. 4).³⁷⁾

Target-specific epigenetic modification
   앞서 언급한 약제들은 유전자 특이성이 없으며 비특이적 탈메틸화는 정상적인 메틸화 과정에서 탈메틸화를 유발시킬 위험성을 가지고 있다. 또 비특이적 메틸화는 종양억제유전자의 발현을 방해한다. 그러므로 특이적인 탈메틸화 방법의 개발이 중요할 것이다.³⁸⁾

두경부 암에서의 Epigenetics
   최근 들어 급속도로 발전하는 연구 분야로 주로 유전자에서 promoter 과메틸화 여부와 임상 병리학적 병기와의 연관관계, 면역염색을 통한 특정 유전자의 발현 감소 및 소실을 관찰하려는 시도가 이루어지고 있다.³⁹⁾ 

E-cadherin
   Trans-membrane glycoprotein으로 세포사이의 부착능에 관여하며 발현이 소실된 경우 종양의 침투성이나 전이와 연관이 있다. Promoter 과메틸화는 두경부암에서 약 46%에서 관찰되었으며 분화도가 떨어지는 경우,³⁹⁾ 낮은 생존율과 연관을 보인다.⁴⁰⁾

Death associated protein kinase(DAPK) 
   이 효소의 감소는 apoptosis의 소실, 세포 불멸, 전이와 연관이 있으며 두경부 암에서 promoter 과메틸화는 27%에서 관찰되었으며 림프절 병기와 연관을 보였다.⁴¹⁾

p16, p15, p14
   세포주기 조절 유전자로 널리 연구되어 있으며 구강편평세포암에서 promoter 과메틸화가 흔하지만(p15: 30%, p16: 76%) 임상병기나 예후와의 연관은 없었다.^42,43)

Deleted in colorectal cancer(DCC)
   DCC 유전자의 메틸화는 구강암에서 하악침범과 연관이 있어 나쁜 예후인자로 밝혀졌다.⁴³⁾

Methylated in tumor(MINT) family CpG islands
   정확한 기능은 모르지만 구강암에서 MINT 1와 MINT 31의 과메틸화가 발생한 경우 좋지 못한 예후를 보였다.⁴⁴⁾

전  망
   DNA 메틸화는 많은 종양의 발생기전에 있어 가장 신뢰 할 수 있는 분자생물학적 변화이다. 현재 epigenetics를 이용한 진단은 암의 존재유무와 조기 발견에 대한 연구가 주를 이루고 있으며 epigenetic 표지자들을 이용하여 암을 유발하는 위험요소를 확인하려는 시도가 이루어지고 있다. 현재까지 다각적 접근으로 많은 메틸화 관련 표지자들을 확인할 수 있었지만 많은 시간과 노력이 필요하기 때문에 epigenetics에 대한 연구를 위해 메틸화 관련 기술개발이 선행되어야 할 것이다. 치료측면에서는 유전자 돌연변이와는 달리 epigenetic 변화는 DNA 메틸화 억제제(5-aza-2'-deoxycytidine)를 통해 쉽게 가역적인 변화를 얻을 수 있다.⁴⁵⁾ 다만 DNA 탈메틸화가 imprinted gene이나, genome 속에 끼어들어 있던 retrovirus 유전자 등을 발현시켜서 예기치 못한 결과를 가져 올 수 있고, centromere 부위를 불안정하게 만들어 염색체 불안정성을 높일 가능성도 있으므로, 탈메틸화 제제들은 속발성 암의 발생 위험도를 높일 것이라는 우려가 있다.⁴⁶⁾ 이는 epigenetics를 이용한 치료법의 개발에서 극복해야 할 중요한 과제 중의 하나이다.

결     론

   빠른 분자생물학의 발전과 더불어 epigenetics는 암의 새로운 진단 및 치료방향을 제시하였으며 조직이나 체액에 떠다니는 DNA로부터 두경부 암의 조기 진단이나 종양 표지자로써의 가능성을 확인하였다. 최근에는 두경부 암을 포함한 고형암의 치료에 있어서도 새로운 DNMT 억제제와 HDAC 억제제의 개발 속에 좀 더 안전하고 효과적인 약제의 다기관 임상시험이 진행 중이다. 그리고 특정 암과 관련된 유전자 특이적 epigenetics의 연구로 두 약제의 병합요법이나 기존의 방사선이나 항암화학요법과의 병용치료를 위한 전임상 및 기초-임상연계시험(translational research)를 통해 가까운 미래에 실용적인 성과들이 기대된다.

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