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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(9): 1267-1273. |
| Expression of Heat Shock Protein 70 in Influenza A Virus Induced Acute Maxillary Sinusitis of Rabbits. |
| Yin Gyo Jung, Il Seok Park, Hyun Ung Kim, Jin Hak Cho, Young Soo Rho, Hyun Joon Lim, Yoon Won Kim |
1Department of Otorhinolaryngology, College of Medicine, Hallym University, Seoul, Korea.
2Department of Microbiology, College of Medicine, Hallym University, Seoul, Korea. |
| Influenza A 바이러스로 유발한 토끼의 상악동염에서 HSP 70 발현에 관한 연구 |
| 정인교1 · 박일석1 · 김현웅1 · 조진학1 · 노영수1 · 임현준1 · 김윤원2 |
| 한림대학교 의과대학 이비인후과학교실1;미생물학교실2; |
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| ABSTRACT |
BACKGROUND:
Heat shock proteins(HSPs) are released from the cells by temperature elevation or other stresses, including cytokines, hypoxia, inflammation or reactive oxygen species.
These proteins likely play a role in cellular repair and survival mechanisms.
OBJECTIVES:
In order to elucidate the relationship between the HSP 70 and viral induced maxillary sinusitis.
MATERIALS AND METHODS:
The degree of HSP expression was evaluated in New Zealand white rabbits with maxillary sinusitis induced by inoculation of Influenza A virus(KOREA /1/ 80/H3N2) into the mucosa. The animals were serially sacrificed 1, 5, 7, 14, 21, 28th day after inoculation. The localization of the induced form of HSP 70 in the normal & infected maxillary mucosa were studied with immunohistochemical staining.
RESULTS:
The normal sinus mucosa did not show any staining for the HSP 70. As contrasted with the normal group, the mucosa of the first day after viral inoculation showed very light staining in the epithelial layer. The degree of immunoreactive staining was gradually increased up to the seventh day. Epithelial layer of the mucosa, cilia and submucosa were heavily stained at seventh day after inoculation, and then the degree was reduced at 14th day.
The staining of the mucosa was completely disappeared at 28th day after viral inoculation.
CONCLUSION:
These results suggest that the HSP 70 was produced from acute stage of the infected mucosa by the Influenza A virus. Presumably, it is closely related to the inflammatory reaction in the mucosa of the maxillary sinus. |
| Keywords:
Influenza A virusㆍHeat Shock Protein 70ㆍSinus mucosa |
서론
세포는 대사과정 또는 주위 환경으로부터 많은 stress에 둘러싸여 자극을 받고 있다. 세포가 이러한 stress에 대해 반응을 나타내는 것을 열충격 반응(heat shock response)이라고 한다. 이러한 열충격 반응은 1962년 Ritossa가 처음으로 초파리에서 열자극에 대한 반응으로 염색체가 부풀어진 것을 관찰하면서 보고되었고1), 1973년 Tissieres 등에 의하여 이러한 염색체의 부풀림은 특이한 단백질의 합성과 관계가 있다는 것이 알려지면서 이 특이 단백을 heat shock protein(HSP)이라고 하였다.2) 그러나 이 HSP은 열충격반응 이외에도 여러가지 다른 자극에 의하여서도 유발된다고 보고되었으며 다른 말로 stress protein이라고도 한다. HSP의 기능은 완전히 밝혀지지는 않았지만 stress로부터 세포를 회복시키고, 또 더 큰 자극으로부터 세포의 손상을 막는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.3)4)5)
HSP는 분자량에 따라 크게 20, 60, 70 및 90 등의 4가지 속(family)으로 구분되며6)7)8) 이중 HSP 70이 가장 잘 알려져 있고 많이 연구되어 왔다. HSP 70은 세포에서 정상적으로 표현되는 구성형(constitutive form；HSP 73)과 다양한 자극 후에 나타나는 유발형(induced form, HSP 72)으로 크게 나눌 수 있으며 이중 유발형인 HSP 72는 다양한 세포에서 여러 자극에 대한 반응으로 합성된다고 보고되었다. Cytokine, hypoxia, 활성산소(reactive oxygen species；ROS) 등의 스트레스에 의해서 HSP가 생성되며, 박테리아나 바이러스 등의 감염에 의해서도 HSP가 생성된다.9)10)
바이러스에 감염되면 많은 염증세포의 조직내 유입과 다양한 정도의 조직 손상이 일어나며11), 이러한 감염이 세포의 방어기전에 관여한다고 알려진 HSP의 생성을 자극할 수 있을 것으로 생각된다.
따라서 본 연구는 급성상기도염의 중요한 원인균의 하나인 Influenza A 바이러스를 가토의 상악동에 주입하여 유발한 상악동염에서 바이러스 감염이 HSP 70의 발현에 어떠한 영향을 미치는지를 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
1. 재료
체중 2kg 전후의 외견상 건강하고 비공이 깨끗한 가토(New Zealand white rabbit) 20마리를 암수의 구별없이 실험동물로 사용하였다.
실험에 사용한 바이러스는 한림대학교 의과대학 미생물학교실에서 배양중인 Influenza A 바이러스：A / Korea / 1 / 80(H 3 N 2)를 부화계의 요낭막강(alantoic sac)에 배양하여 실험전까지 -70℃에 보관하였다가, 실험시 해빙하여 혈구응집저지시험(hemagglutination inhibition test)과 세포배양으로 역가를 측정하여 Eagle’s minimum essential medium을 첨가하여 적절한 농도(2×10 7 plaque forming units /ml, 이하 p.f.u.로 약함)로 희석하여 사용하였다.
2. 방법
1) 바이러스의 주입
토끼를 Ketamine(50mg /kg)으로 전신마취한 후 혈액을 채취한 다음, 코 주위의 털을 깎고 우측 상악동 측벽을 베타딘 용액과 알코올로 소독한 후 천자흡인하여 동내에 저류액 등의 병변이 없는 것을 확인하였다. 피부반응검사용 주사기를 이용하여 상악동내에 바이러스 부유액을 0.3ml(7×10 6 p.f.u.)씩 주입하였으며 대조군은 같은 양의 배양액만을 주입하였다. 그 후 바이러스 주입전과 같은 환경에서 사육하면서 1, 5, 7, 14, 28일에 각각 3마리씩 전신마취하에 혈액을 채취하고, 상악동을 노출하여 저류액의 유무와 점막을 육안 관찰하고 병리조직학적 검사를 위하여 상악동 내측벽의 점막을 채취하였다.
바이러스 주입전과 희생시 심장에서 채취한 혈액을 원심분리하여 얻은 혈청은 -70℃에 보관하였다가 혈구응집저지시험을 시행하여 바이러스 주입전에 비하여 항체 역가가 4배 이상 증가한 경우 감염이 되었다고 판단하였다.12)
2) 면역조직화학적 염색 및 관찰
골막을 포함하여 적출한 상악동 내측벽 점막을 10% 포르말린 용액에 24시간 고정한 후 파라핀 포매 과정을 거친 조직은 4∼5μm 두께로 박절하여 streptavidinbiotin complex에 의한 immunoperoxidase 염색법으로 염색하였다. 염색은 파라핀 포매된 조직절편을 만들어 xylene으로 2회 탈파라핀화 시킨 뒤, 통상적인 함수과정을 거쳤다. 0.1% hydrogen peroxide에 30분간 처리하여 조직내의 내인성 과산화효소의 활성을 억제시킨 다음 phosphate buffered saline(10mM, pH7.4, 이하 PBS로 약함)으로 수세하였다. 그후 0.001 N HCl이 포함된 0.1% pepsin으로 상온에 15분간 방치한 다음 증류수로 세척한 후 조직내의 비특이적 항원 항체 반응을 억제하기 위하여 조직을 양의 10% 비면역 혈청에 10분간 작용시킨 뒤, 1차 항체로는 1：100으로 희석한 항 HSP 72/73 단크론항체(Oncogene Science, Cambridge, Massachusetts, USA)를 37℃에서 1시간 도포하고, PBS로 수세한 뒤 2차 연결 항체를 30분간 반응시켰다. PBS로 수세후 streptavidin-peroxidase(Zymed Laboratories Inc.)를 30분간 반응시키고 다시 PBS로 수세한 뒤, peroxidase의 기질액인 hydrogen peroxide와 발색제인 AEC(3-amino-9-ethyl carbarzole, Zymed Laboratories Inc.)를 10분간 반응시켜 정색반응을 일으켜 hematoxylin으로 대조염색후 GVA-mount(Zymed Laboratories Inc.)로 wet mounting하여 광학현미경으로 관찰하였다.
음성대조군으로는 일차항체대신 PBS를 사용하였으며, 양성 대조군으로는 정상 가토의 점막 및 바이러스 대신 배양액만을 주입한 가토의 상악동 점막 조직을 사용하였다.
연구성적
1. 육안소견
실험 기간중 사망한 동물은 없었다. 감염 7일까지 실험측 상악동에 점액성 분비물이 있었으나, 14일후부터는 소실 되었고 반대측 상악동에서는 분비물을 관찰할 수 없었다.
2. 혈청학적 검사 소견
적혈구응집저지시험을 시행한 결과 바이러스 주입전 항체 역가는 모두 32이하이나, 주입 후에는 모든 군에서 512에서 2048까지의 역가를 보여 대조군에 비하여 모두 4배 이상으로, 바이러스의 감염이 되었다고 판정할 수 있었다.
3. 면역조직화학적 염색
면역조직화학적 방법으로 염색한 조직 표본의 현미경적 관찰은 광학현미경의 저배율로 염색양상을 확인하여 세포질이나 세포막을 따라 갈색으로 염색된 경우를 양성으로 판정하고, 저배율에서 양성반응이 비교적 강한 부위를 고배율로 관찰하여 다음과 같이 판정하였다.
1차항체 대신 PBS만 도포시킨 표본을 사용하여 그 염색 강도를 음성(-)으로 정하였고, 진한 갈색으로 염색된 경우를 양성으로 판정하였으며 염색양상에 따라 상피세포, 배세포, 점막하 선세포 및 섬모주위로 나누어 관찰하였다.
정상 상악동 점막조직 및 일차항체 대신 PBS로 도포한 조직에서는 어느부위에서도 HSP 70의 발현을 관찰할 수 없었다(Fig. 1). 감염후 1일이 경과하면 기저세포에 가까운 상피층부터 약한 발현이 시작되어(Fig. 2), 5일 군에서는 좀더 강한 면역반응을 보이기 시작하였다(Fig. 3). 조직변화가 가장 심한 7일 군에서 가장 강한 면역반응을 보여 상피세포와 섬모주위 및 점막하층에서도 발현됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 4). 14일 군에서도 약한 발현을 관찰할 수 있었으나(Fig. 5) 5일 군에 비해서는 그 강도가 약하였고 상피세포 전층에서 관찰할 수 있으나 점막하층에서는 관찰할 수 없었다. 4주 군에서는 점막 전층에서 관찰할 수 없었다(Fig. 6).
고찰
급성 상기도염은 다양한 바이러스에 의하여 발생하는 복합감염으로 대부분 rhinovirus, adenovirus, corona virus 및 myxo-, paramyxovirus등의 항원성이 서로 다른 4개의 바이러스 군에 의하여 일어난다.
바이러스에 감염되면 점막하층의 부종에 이어 염증세포의 침윤과 호흡 상피세포, 특히 섬모의 파괴를 시작으로 섬모세포의 파괴 및 박탈이 일어나며 감염 5일후부터 기저세포가 증식하기 시작하여 약 4주가 지나면 정상으로 회복된다고 하였다.13)14)15)
본 실험에서도 혈청학적 검사를 통하여 바이러스에 감염되었음을 확인할 수 있었으며, 바이러스 주입 후 1일 군부터 조직학적 변화가 시작되어 섬모의 크기가 작아지고 배열상이 흐트러지며 대식세포 및 다형핵구 등의 염증세포가 나타나기 시작하여, 5일 군에서는 그 정도가 더욱 심하여지고 감염 7일군에서 가장 심한 조직학적 변화를 관찰할 수 있었다. 섬모가 완전히 소실되고 상피세포의 퇴행성 변화 및 탈락이 관찰되었으며 이후 회복되기 시작하여 28일이 경과하면 형태학적으로 정상소견을 보여 유사한 결과를 얻었다.
바이러스 감염이 이러한 형태학적 변화를 일으킬 뿐만 아니라, 다양한 면역반응과 더불어 감염으로부터 살아남기 위한 반응들이 일어난다.
HSP은 열자극 이외에도 허혈, 손상, 강한 음자극 및 생체이물, 중금속, 에너지 대사물질의 억제제, 아미노산 유사물질과 박테리아 및 바이러스 등의 독성 환경에 노출된 경우 증가하는 것으로 보고되었으며16)17)18), HSP의 생성은 감염후 염증반응과 밀접한 관계를 가지고 있다. 바이러스의 감염은 다형핵구, 중성구, 림파구 및 대식세포 등의 염증세포를 조직내로 침입하게 하고 prostaglandin과 leukotriene 등의 lipid mediator, IL-1, TNF 등의 cytokines과 free-radical superoxide anion(O2-), hydroxyl radicals(OH) 및 hydrogen peroxide(H2O2) 등의 활성산소(reactive oxygen species；ROS) 등 염증에 관계된 다양한 종류의 인자가 나타나게 된다. 이러한 인자들과 HSP와의 관계에 관한 연구로는 1991년 Li 등이 thermotolerance와 HSP 70의 생성과의 관계를 규명한 이래19), hydrogen peroxide의 독성20), ethanol에 의한 세포손상21) 등의 oxidative stress에 의하여 HSP 70의 생성이 증가한다고 발표하였다. 또한 Ferris 등은 염증세포에 의해서 생성된 cytokines이 HSP의 생성을 유발하며22), Polla 등은 활성산소로 HSP의 생성이 증가하나, superoxide anion 자체로는 HSP생성을 자극하지 못하고, 그 대사물인 hydrogen peroxide가 HSP의 생성을 자극한다고 하였다. 염증상태에서는 탐식구에서 phagocyte-mediated oxygen free radical이 생성되고 이것이 탐식된 미생물을 죽이고 때로는 세포 독성을 나타내어 세포손상을 일으키며 또한 화학주성인자를 활성화시켜 염증반응을 촉진시킨다.23)24)25) Hydrogen peroxide는 활성화된 탐식작용 이외에도 enzymatic dismutation에 의한 peroxide anion으로 부터 생성된다. 또한 폐렴구균 같은 박테리아도 hydrogen peroxide를 만드는데 이는 박테리아가 죽으면서 발생한다고 하였다.3)
비록 HSP의 역할에 대하여는 완전히 규명되지는 않았지만 oxygen free radicals를 포함한 외부자극이나 열 자극으로부터 세포가 살아남기 위하여 매우 중요한 역할을 하고 있다. HSP는 단백질의 folded과 unfolded 폴리펩타이드의 분절과 결합하여 조립되고, 단백질이 집합되는(aggregation) 경향을 감소시키는 역할을 할뿐 아니라 열에 대한 내성, 면역반응 및 oxidative stress에 중요한 역할을 한다.26) 이로 보아 HSP는 염증에 있어서 병태생리적인 중요한 역할을 담당하며, 이러한 oxidative injury에 대한 방어효과는 antioxidant 기전에 의한 것이라고 생각한다.3) 항산소(antioxidant) 역할을 갖는 효소 중에는 stress protein families에 속하는 superoxide dismutase와 32kDa oxidation specific protein heme oxygenase 등이 있으며 이는 염증 및 탐식작용중에 발생한 활성산소를 제거하는 역할을 한다.3)
Egusa 등은 폐렴구균을 이용한 중이염 모델에서 폐렴구균 주입후 1일째 중이점막의 상층부에 HSP 70의 증가를 보이기 시작하다가 5일이 경과하면 점차 감소한다고 하여 열 또는 음자극 후 수시간내에 HSP 70의 증가를 관찰한 다른 논문27)28)과 유사한 결과를 보였으나, 형태학적 변화는 5일 군에서 가장 심한 변화를 보여, 염증의 정도를 HSP 70의 양으로 판단하기는 어렵다고 하였다.29) 본 연구에서도 감염 1일부터 HSP 70이 발현되기 시작하여 비슷한 성적을 얻었으나, 조직변화가 가장 심한 7일에서 가장 많이 표현되고, 점차 감소하여 28일이 경과하면 표현되지 않았다. 이 결과와 다른보고를 참고하면 감염 초기에는 염증세포에서 유도된 세포산물이 HSP 70의 생성을 유도한다고 볼 수 있으나, 본 연구에서 HSP 70은 조직손상이 가장 심한 7일에서 가장 높게 표현 된 것으로 보아 향후 5일과 14일 사이를 세분화하여 HSP 70과 염증의 진행에 따른 세포산물과의 관련성을 연구할 필요가 있다고 생각된다. 또한 ELISA 또는 Blotting 방법으로 HSP의 정량분석이 필요하다고 생각되며 활성산소와의 관계에 대한 연구도 필요할 것으로 생각된다.
결론
결국 HSP70이 stress에 의해 유발된 protein의 발현이라는 측면에서, 본연구의 결과에 나타난 면역조직학적 변화는 influenza A virus 감염이라는 stress에 의해 유발된 결과로 볼 수 있으며 또한, HSP70의 발현은 Influenza A 바이러스 감염후 염증의 정도와 밀접한 관련성이 있음을 알 수 있다.
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